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真核表达his-tag蛋白纯化后没有活性
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具体的实验总结： 1. 表达载体pHis1522，表达菌Bacillus Megaterium，中文叫巨大芽孢杆菌，木糖启动子 2. 目的蛋白A很大，300多KD，his-tag在蛋白c端 3. 成熟的protocal和paper，之前的实验室其他人提取出来过 4. 我表达后电泳跑出来了，但是没有毒性 5. 表达的时候同时做了与其同源的同构建载体的另一个蛋白B的表达，同protocal，没有问题，当然，B表达量高 6. 因为实验室不是做蛋白的实验室，没有高级的纯化系统，用的是Merck的重力柱，手动梯度洗脱。 现在很纠结的就是没活性，木糖启动子是37度诱导，paper上说的是12-16h诱导，我降温到30度，提取没活性，降温到25度，不挂柱，超声2s，停10s binding buffer 没有咪唑的 |
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reallpf
木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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先要确定问题出在表达还是纯化阶段：拿阳性对照，同时测纯化前后样品的活力。 如果是纯化阶段，建议测序检验His-tag是否加在基因后面了；如果成功添加His-tag，就要从纯化的方式上考虑了。 如果没有较好的纯化柱子，建议将样品超滤脱盐后测酶活。因为离子对酶活也会有影响。 如果纯化前的样品就没有活力，那么问题就比较复杂了。因为你的SDS-PAGE结果有目的蛋白，而且是在成熟protocol和paper的基础上，那么可以确定蛋白是得到表达了，而且方法没有问题。所以需要从你使用的宿主考虑了。我朋友的经历，表达一个酶，比你的结果更奇怪，总是有条带没酶活或者有较低酶活但是没有条带。 认为需要确认酶是否需要某些后加工，而使用的宿主无法提供；或者有酶原序列的问题；另外可以考虑真对你的宿主优化密码子以及培养发酵条件。 个人观点。 |
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