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目的基因连接到克隆载体后提取质粒测序，序列有问题
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| 虫友们帮帮忙，我以质粒为模板进行PCR，之后连接到T载体上，转化入大肠杆菌中，提取质粒，双酶切鉴定，但是几个菌落酶切后的目的基因片段大小有点差别，有750bp的，有700bp左右的，还有650bp左右的。我就将这三个都拿去测序，结果750bp的是我要的序列，但是另外两个稍微短一些的序列也是我的序列，只不过中间分别少了十几个和二十几个氨基酸，其它的氨基酸序列都与正确的序列是一样的。怎么会发生这种情况呢？难道在大肠杆菌中发生剪接了，剪掉了一些氨基酸？有虫友碰到过这种情况吗？ |
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 分子生化实验经验积累 | 重复序列PCR扩增 |
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5楼2012-12-20 20:20:05
gyesang
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【答案】应助回帖
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首先，指出你描述问题的错误的地方， “只不过中间分别少了十几个和二十几个氨基酸，其它的氨基酸序列都与正确的序列是一样的。”这里不是氨基酸序列，你描述的应该是核苷酸序列 “难道在大肠杆菌中发生剪接了，剪掉了一些氨基酸？”这里同样应是核苷酸序列。 “有750bp的，有700bp左右的，还有650bp左右的”，“结果750bp的是我要的序列，但是另外两个稍微短一些的序列也是我的序列，只不过中间分别少了十几个和二十几个氨基酸，其它的氨基酸序列都与正确的序列是一样的。” 据你描述这三个质粒应该都是你的引物扩增出来的，但有两个出现了两个质粒中间缺少一段序列的情况，我觉得你的序列中可能存在重复序列，然后PCR后，会少一个重复，你分析下你的序列，看看是不是我说的这种情况，也就是找下你的序列中有没有一段是重复序列。 |
2楼2012-12-19 23:25:09
3楼2012-12-20 05:59:59
cicelyzh
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4楼2012-12-20 09:22:13
10