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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的基因连接到克隆载体后提取质粒测序，序列有问题
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hyx312312

铁虫 (初入文坛)

[求助] 目的基因连接到克隆载体后提取质粒测序，序列有问题

虫友们帮帮忙，我以质粒为模板进行PCR，之后连接到T载体上，转化入大肠杆菌中，提取质粒，双酶切鉴定，但是几个菌落酶切后的目的基因片段大小有点差别，有750bp的，有700bp左右的，还有650bp左右的。我就将这三个都拿去测序，结果750bp的是我要的序列，但是另外两个稍微短一些的序列也是我的序列，只不过中间分别少了十几个和二十几个氨基酸，其它的氨基酸序列都与正确的序列是一样的。怎么会发生这种情况呢？难道在大肠杆菌中发生剪接了，剪掉了一些氨基酸？有虫友碰到过这种情况吗？
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分子生化实验经验积累 重复序列PCR扩增

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学无止境
1楼 2012-12-19 22:09:09
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先，指出你描述问题的错误的地方，
“只不过中间分别少了十几个和二十几个氨基酸，其它的氨基酸序列都与正确的序列是一样的。”这里不是氨基酸序列，你描述的应该是核苷酸序列
“难道在大肠杆菌中发生剪接了，剪掉了一些氨基酸？”这里同样应是核苷酸序列。

“有750bp的，有700bp左右的，还有650bp左右的”，“结果750bp的是我要的序列，但是另外两个稍微短一些的序列也是我的序列，只不过中间分别少了十几个和二十几个氨基酸，其它的氨基酸序列都与正确的序列是一样的。” 据你描述这三个质粒应该都是你的引物扩增出来的，但有两个出现了两个质粒中间缺少一段序列的情况，我觉得你的序列中可能存在重复序列，然后PCR后，会少一个重复，你分析下你的序列，看看是不是我说的这种情况，也就是找下你的序列中有没有一段是重复序列。
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2楼2012-12-19 23:25:09
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shujunru

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该是你的PCR反应条件有问题，扩增出来的不是大小均一的片段，你跑胶用的多大的胶？浓度对的话，应该可以在这一步把杂带去掉
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3楼2012-12-20 05:59:59
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
错误最大可能是发生在PCR那一步，可能是PCR条件不是最优化的。如果中间丢掉了一些核苷酸，如果不是恰好3的倍数，翻译产物完全不一样了，不可能还是原来的氨基酸序列吧。
再说，如果得到了正确的克隆就不要再纠结了。
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4楼2012-12-20 09:22:13
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hyx312312

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-20 09:22:13
错误最大可能是发生在PCR那一步，可能是PCR条件不是最优化的。如果中间丢掉了一些核苷酸，如果不是恰好3的倍数，翻译产物完全不一样了，不可能还是原来的氨基酸序列吧。
再说，如果得到了正确的克隆就不要再纠结了 ...

那我正好丢的是3的倍数，剩下的所有的氨基酸都一样一样的。这个该怎么解释啊？
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学无止境
5楼2012-12-20 20:20:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by hyx312312 at 2012-12-20 20:20:05
那我正好丢的是3的倍数，剩下的所有的氨基酸都一样一样的。这个该怎么解释啊？...

可能是凑巧了吧。一般情况下是PCR的时候错的，不会保持阅读框。
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6楼2012-12-21 07:43:29
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easterntri
7楼2012-12-21 08:31:20
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platanus

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得是你的序列中有什么特殊的结构使你的片段在复制的过程中导致部分小片段丢失造成的，因为你是质粒酶切之后出现的差异，而不是PCR产物才出现差异的。
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8楼2012-12-21 11:59:32
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hyx312312

铁虫 (初入文坛)
gyesang: 回帖置顶 2012-12-23 00:07:43
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2012-12-19 23:25:09
首先，指出你描述问题的错误的地方，
“只不过中间分别少了十几个和二十几个氨基酸，其它的氨基酸序列都与正确的序列是一样的。”这里不是氨基酸序列，你描述的应该是核苷酸序列
“难道在大肠杆菌中发生剪接了，剪 ...

你好，先谢谢你的回复。不过我知道氨基酸和核苷酸的区别，我拿到测序后的结果确实是核苷酸，我是将ORF翻译成氨基酸后进行比对的，我只需要找到正确的氨基酸序列就行，不用考虑核苷酸的问题，所以我就直接提的是氨基酸啦。
另外，你太聪明了，我这个序列确实是有重复，而且丢失的这段就是重复的那段，不过为什么重复的部位会丢失呢？
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学无止境
9楼2012-12-21 21:39:54
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hyx312312

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by platanus at 2012-12-21 11:59:32
我觉得是你的序列中有什么特殊的结构使你的片段在复制的过程中导致部分小片段丢失造成的，因为你是质粒酶切之后出现的差异，而不是PCR产物才出现差异的。

谢谢你的回答，我的序列中有重复序列，不过为什么这种特殊的结构会在复制时丢失呢？请问你知道原因吗？
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学无止境
10楼2012-12-21 21:41:18
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