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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的基因连接到克隆载体后提取质粒测序，序列有问题
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hyx312312

铁虫 (初入文坛)

[求助] 目的基因连接到克隆载体后提取质粒测序，序列有问题

虫友们帮帮忙，我以质粒为模板进行PCR，之后连接到T载体上，转化入大肠杆菌中，提取质粒，双酶切鉴定，但是几个菌落酶切后的目的基因片段大小有点差别，有750bp的，有700bp左右的，还有650bp左右的。我就将这三个都拿去测序，结果750bp的是我要的序列，但是另外两个稍微短一些的序列也是我的序列，只不过中间分别少了十几个和二十几个氨基酸，其它的氨基酸序列都与正确的序列是一样的。怎么会发生这种情况呢？难道在大肠杆菌中发生剪接了，剪掉了一些氨基酸？有虫友碰到过这种情况吗？
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分子生化实验经验积累 重复序列PCR扩增

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学无止境
1楼2012-12-19 22:09:09
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hyx312312

铁虫 (初入文坛)
gyesang: 回帖置顶 2012-12-23 00:07:43
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2012-12-19 23:25:09
首先，指出你描述问题的错误的地方，
“只不过中间分别少了十几个和二十几个氨基酸，其它的氨基酸序列都与正确的序列是一样的。”这里不是氨基酸序列，你描述的应该是核苷酸序列
“难道在大肠杆菌中发生剪接了，剪 ...

你好，先谢谢你的回复。不过我知道氨基酸和核苷酸的区别，我拿到测序后的结果确实是核苷酸，我是将ORF翻译成氨基酸后进行比对的，我只需要找到正确的氨基酸序列就行，不用考虑核苷酸的问题，所以我就直接提的是氨基酸啦。
另外，你太聪明了，我这个序列确实是有重复，而且丢失的这段就是重复的那段，不过为什么重复的部位会丢失呢？
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学无止境
9楼2012-12-21 21:39:54
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先，指出你描述问题的错误的地方，
“只不过中间分别少了十几个和二十几个氨基酸，其它的氨基酸序列都与正确的序列是一样的。”这里不是氨基酸序列，你描述的应该是核苷酸序列
“难道在大肠杆菌中发生剪接了，剪掉了一些氨基酸？”这里同样应是核苷酸序列。

“有750bp的，有700bp左右的，还有650bp左右的”，“结果750bp的是我要的序列，但是另外两个稍微短一些的序列也是我的序列，只不过中间分别少了十几个和二十几个氨基酸，其它的氨基酸序列都与正确的序列是一样的。” 据你描述这三个质粒应该都是你的引物扩增出来的，但有两个出现了两个质粒中间缺少一段序列的情况，我觉得你的序列中可能存在重复序列，然后PCR后，会少一个重复，你分析下你的序列，看看是不是我说的这种情况，也就是找下你的序列中有没有一段是重复序列。
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2楼2012-12-19 23:25:09
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shujunru

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该是你的PCR反应条件有问题，扩增出来的不是大小均一的片段，你跑胶用的多大的胶？浓度对的话，应该可以在这一步把杂带去掉
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3楼2012-12-20 05:59:59
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
错误最大可能是发生在PCR那一步，可能是PCR条件不是最优化的。如果中间丢掉了一些核苷酸，如果不是恰好3的倍数，翻译产物完全不一样了，不可能还是原来的氨基酸序列吧。
再说，如果得到了正确的克隆就不要再纠结了。
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4楼2012-12-20 09:22:13
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