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shijunyu0618至尊木虫 (著名写手)
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WB条带周围黑黑的一团！！！！！
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最近做ＷＢ，发现每次条带周围都有黑黑的一团，不知道是怎么回事。 请大虾指点！ 我用的一抗１:５０００和二抗１:２００００，都是ａｂｃａｍ的。 显色液是pierce，SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate。 ３％的ＢＳＡ封闭１．５小时。 一抗（用３％的ＢＳＡ配制）４度过夜 ＴＢＳＴ洗３次，每次２０分钟 孵二抗１．５小时 ＴＢＳＴ洗３次，每次２０分钟 显色  未命名.jpg |
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porphybaby
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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wizardfan: 金币+5, 分析得很透彻 2012-12-19 08:07:46
shijunyu0618: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-12-20 14:47:49
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shijunyu0618: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-12-20 14:47:49
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我反而觉得是你洗的时间太长了。 第一 建议用5%脱脂奶粉封闭，有条件的话封闭过夜，室温下至少封闭1小时。 第二 你 一抗二抗 稀释液应该都用 含脱脂奶粉的来配，这样可以降低背景。如果你一抗二抗的稀释液都仅是TBST，那你孵育那么长时间，一直摇动啊啥的，会不会把已经封闭的区域又过度洗涤了呢？然后又结合上去了呢？ 第三 这种现象我也遇到过，很可能是你一抗或二抗刚刚稀释之后，没有混均匀，然后就把膜放下去了。有的时候局部浓度特别大的时候，会造成严重的非特异性结合。 第四 洗膜不需要洗那么长时间的。一般洗3次，每次6~7分钟就可以了。敷完二抗之后洗3次，每次10分钟。 |
7楼2012-12-18 22:53:17
hallen6891
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2楼2012-12-18 17:14:29
1470776
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3楼2012-12-18 17:22:41
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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amisking: 回帖置顶 2012-12-18 20:08:38
amisking: 金币+3, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-12-18 20:08:46
shijunyu0618: 金币+10, ★★★很有帮助, 今天把二抗浓度提高到了1:5万。情况类似，但是颜色笔之前的淡了。 2012-12-20 14:42:54
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泳道内背景高，泳道外背景不高。不是封闭的原因，不是显影的原因，也不是漂洗不够，而是一抗或二抗的非特异性结合。 建议：减少一抗或二抗的作用时间，必要时降低浓度 蛋白上样量不要太高，最好不高于150 μg/孔 |
4楼2012-12-18 18:24:15
