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zdx516铁虫 (小有名气)
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[求助]
求助：本人准备做一个细菌中某个基因的敲除，想用同源重组的方法做
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本人想要对细菌的某个基因，进行基因敲除，用同源重组的方法，以接合的方式转化，初次接触，都不懂，请问有做过的大侠么，具体程序，步骤是啥呀， 万分感谢呀 |
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xiaoxia110
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2楼2013-02-20 20:22:03
【答案】应助回帖
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基本设计方法来自Church 1997年的文章 Methods for Generating Precise Deletions and Insertions in the Genome of Wild-Type Escherichia coli: Application to Open Reading Frame Characterization 在其他细菌里，你还需要保证有重组酶，一个反向选择基因可用（sacB在一般Gram-里面都可以），最好有一个在你目标菌中的自杀质粒，一个可以筛选区分e. coli和你的目的菌的办法, 比如某种抗生素能杀e. coli 杀不了你的目标菌 有一个shewanella的protocol，其他也没啥大区别，方法都是一样的 PROTOCOL FOR IN-FRAME DELETION MUTAGENESIS |
3楼2013-02-20 22:31:23
果园4楼2013-02-21 10:24:39
zdx516
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6楼2014-11-28 00:47:56
guosong0804
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7楼2015-09-02 12:38:39
lucklizhen
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8楼2026-09-27 16:17:49
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（个人观点，仅供参考，如有不对的地方请大佬指正） 第一步：构建自杀质粒 1. 从目标菌基因组中PCR扩增待敲除基因的上下游序列作为同源臂 2. 选择一个目标菌敏感的抗生素标记基因 3. 将同源臂和抗性基因克隆到自杀载体上，载体上还应带有ori、oriT、mob、recA、sacB等元器件 第二步：接合转移 1. 构建好的自杀质粒转化到合适的大肠杆菌供体菌株中进行筛选培养，再与同为培养至对数生长期的受体菌混合、共培养 2. 共培养后转移到含有外源抗性标记物的筛选培养基，筛一遍，再用受体菌本身的抗性标记物筛选培养基培养，筛出整合的受体菌 3. 通过PCR或者蔗糖培养基筛选出双交换的单克隆菌株 链球菌也可以用这个方法，但是自杀质粒载体上的一些元器件需要改变 |
9楼2026-10-09 11:16:37
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