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zdx516

铁虫 (小有名气)

[求助] 求助：本人准备做一个细菌中某个基因的敲除，想用同源重组的方法做

本人想要对细菌的某个基因，进行基因敲除，用同源重组的方法，以接合的方式转化，初次接触，都不懂，请问有做过的大侠么，具体程序，步骤是啥呀，
万分感谢呀
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1楼2012-12-02 16:58:41
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xiaoxia110

木虫 (正式写手)
同求，有没有相关的书籍或实验手册之类的？
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2楼2013-02-20 20:22:03
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

基本设计方法来自Church 1997年的文章
Methods for Generating Precise Deletions and Insertions in the Genome of Wild-Type Escherichia coli: Application to Open Reading Frame Characterization

在其他细菌里，你还需要保证有重组酶，一个反向选择基因可用（sacB在一般Gram-里面都可以），最好有一个在你目标菌中的自杀质粒，一个可以筛选区分e. coli和你的目的菌的办法, 比如某种抗生素能杀e. coli 杀不了你的目标菌

有一个shewanella的protocol，其他也没啥大区别，方法都是一样的
PROTOCOL FOR IN-FRAME DELETION MUTAGENESIS
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3楼2013-02-20 22:31:23
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chuxuan

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zdx516: 金币+5 2013-02-24 16:06:55
1、先提取要敲除菌的总DNA
2、设计引物 PCR（构建两个同源臂，就是你要敲除基因的上游系列跟下游系列）
3、然后要找个自杀性载体，讲这两个同源臂连到载体上去（再连个筛选标记）
4、将构建好的载体转化到大肠
5、最后，大肠跟菌株做接合转移
6、长出来的接合子进行筛选  验证
大体应该就这样吧。。
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果园
4楼2013-02-21 10:24:39
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zdx516

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-02-20 22:31:23
基本设计方法来自Church 1997年的文章
Methods for Generating Precise Deletions and Insertions in the Genome of Wild-Type Escherichia coli: Application to Open Reading Frame Characterization

在其他细 ...

非常感谢，我的菌比较特殊，它是柔膜菌纲，类似于支原体，它能抗卡那，氨苄，只有四环素还可以杀它，还差一个筛选标记，红霉素可以，就是找不到抗性基因。
我不知道我的菌表达不表达重组酶，它基因组中含有l两个重组酶A（recA）基因，这样可以么？一个反向选择基因这是啥？哎，而且我没有自杀质粒，请问可以在质粒PUC19的lacZ位置插入两个同源臂，并在两同源臂之间插入四环素抗性基因，在质粒上再另外加其他起作用的抗生素抗性基因，改成用电转的方法使构建的新质粒转到我的菌中，这样能行吗？
谢谢大侠的帮助
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5楼2013-02-24 16:29:37
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果园

金虫 (正式写手)

SB
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by chuxuan at 2013-02-21 10:24:39
1、先提取要敲除菌的总DNA
2、设计引物 PCR（构建两个同源臂，就是你要敲除基因的上游系列跟下游系列）
3、然后要找个自杀性载体，讲这两个同源臂连到载体上去（再连个筛选标记）
4、将构建好的载体转化到大肠
...

您好，有具体的实验方法吗？分享个，也要做了，大概原理你说的挺清楚了
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OK
6楼2014-11-28 00:47:56
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guosong0804

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chuxuan at 2013-02-21 10:24:39
1、先提取要敲除菌的总DNA
2、设计引物 PCR（构建两个同源臂，就是你要敲除基因的上游系列跟下游系列）
3、然后要找个自杀性载体，讲这两个同源臂连到载体上去（再连个筛选标记）
4、将构建好的载体转化到大肠
...

你好，我是做链球菌的，想敲掉毒力基因，新入实验室，想尝试这个，但是。。表示很晕。我想问一下：构建好的质粒先转进大肠复制是么？大肠能不能接合转移给链球菌呢？
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7楼2015-09-02 12:38:39
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