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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：本人准备做一个细菌中某个基因的敲除，想用同源重组的方法做
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zdx516

铁虫 (小有名气)

[求助] 求助：本人准备做一个细菌中某个基因的敲除，想用同源重组的方法做

本人想要对细菌的某个基因，进行基因敲除，用同源重组的方法，以接合的方式转化，初次接触，都不懂，请问有做过的大侠么，具体程序，步骤是啥呀，
万分感谢呀
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1楼 2012-12-02 16:58:41
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棒棒虫

新虫 (初入文坛)
（个人观点，仅供参考，如有不对的地方请大佬指正）
第一步：构建自杀质粒
1. 从目标菌基因组中PCR扩增待敲除基因的上下游序列作为同源臂
2. 选择一个目标菌敏感的抗生素标记基因
3. 将同源臂和抗性基因克隆到自杀载体上，载体上还应带有ori、oriT、mob、recA、sacB等元器件
第二步：接合转移
1. 构建好的自杀质粒转化到合适的大肠杆菌供体菌株中进行筛选培养，再与同为培养至对数生长期的受体菌混合、共培养
2. 共培养后转移到含有外源抗性标记物的筛选培养基，筛一遍，再用受体菌本身的抗性标记物筛选培养基培养，筛出整合的受体菌
3. 通过PCR或者蔗糖培养基筛选出双交换的单克隆菌株
链球菌也可以用这个方法，但是自杀质粒载体上的一些元器件需要改变
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9楼2026-10-09 11:16:37
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xiaoxia110

木虫 (正式写手)
同求，有没有相关的书籍或实验手册之类的？
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2楼2013-02-20 20:22:03
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

基本设计方法来自Church 1997年的文章
Methods for Generating Precise Deletions and Insertions in the Genome of Wild-Type Escherichia coli: Application to Open Reading Frame Characterization

在其他细菌里，你还需要保证有重组酶，一个反向选择基因可用（sacB在一般Gram-里面都可以），最好有一个在你目标菌中的自杀质粒，一个可以筛选区分e. coli和你的目的菌的办法, 比如某种抗生素能杀e. coli 杀不了你的目标菌

有一个shewanella的protocol，其他也没啥大区别，方法都是一样的
PROTOCOL FOR IN-FRAME DELETION MUTAGENESIS
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3楼2013-02-20 22:31:23
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chuxuan

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zdx516: 金币+5 2013-02-24 16:06:55
1、先提取要敲除菌的总DNA
2、设计引物 PCR（构建两个同源臂，就是你要敲除基因的上游系列跟下游系列）
3、然后要找个自杀性载体，讲这两个同源臂连到载体上去（再连个筛选标记）
4、将构建好的载体转化到大肠
5、最后，大肠跟菌株做接合转移
6、长出来的接合子进行筛选  验证
大体应该就这样吧。。
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果园
4楼2013-02-21 10:24:39
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