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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 综合其他 » 假阳性克隆的问题
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 假阳性克隆的问题

最近一直在做克隆，用的载体是TAKARA的PMD18-T，
克隆的DNA片段1100bp左右，为普通TAQ酶（非保真）扩增。
筛选蓝白斑后挑白斑做PCR快速鉴定很久都检测不到阳性结果（如图），然后听取网友建议将94的预变性时间改为10分钟，侥幸得到2个弱弱的条带，然后挑其他白斑重复均得不到有效结果。非常奇怪、原来做这种克隆一个星期以内绝对会出结果，随便挑斑就能出来。现在怎么这么难，挑了10-20个克隆还不能出现阳性。
弱弱问下各位帮忙分析下可能的原因在哪里？
如果是假阳性问题，那么怎么才能提高转化效率？

另外，一直不得解的是电泳图上方泳道口的带是什么？有人说是蛋白，但是蛋白也能被EB染色吗？

junye pcr.JPG
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1楼 2012-11-07 10:26:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyfgood: 金币+3, 很有用的答案！ 2012-11-10 00:39:59
减少假阳性最好的办法就是做克隆时严格控制条件。比方说做连接时你的PCR产物的用量。
此外，菌落PCR模板比较脏，而且量很难控制，点样孔出有些亮是正常现象。被EB染色的不是蛋白，是细菌DNA蛋白复合物。
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2楼2012-11-07 14:58:24
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titus0805

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得可能是没转进去。菌长得正常吗？一般氨苄抗性的超过10个小时长出来的菌就不一定是转化进去的了
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3楼2012-11-09 09:02:22
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-07 14:58:24
减少假阳性最好的办法就是做克隆时严格控制条件。比方说做连接时你的PCR产物的用量。
此外，菌落PCR模板比较脏，而且量很难控制，点样孔出有些亮是正常现象。被EB染色的不是蛋白，是细菌DNA蛋白复合物。

谢谢,原因找到了，克隆12小时后就要挑菌了，否则时间长了，内酰胺酶会降解氨苄，就会生长很多空载的小菌
结果我挑的菌就是卫星菌落

实验室人少没交流，痛苦！
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4楼2012-11-09 20:38:37
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by titus0805 at 2012-11-09 09:02:22
我觉得可能是没转进去。菌长得正常吗？一般氨苄抗性的超过10个小时长出来的菌就不一定是转化进去的了

谢谢,原因找到了，克隆12小时后就要挑菌了，否则时间长了，内酰胺酶会降解氨苄，就会生长很多空载的小菌
结果我挑的菌就是卫星菌落

实验室人少没交流，痛苦！
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5楼2012-11-09 20:39:10
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titus0805

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by charles08 at 2012-11-09 20:39:10
谢谢,原因找到了，克隆12小时后就要挑菌了，否则时间长了，内酰胺酶会降解氨苄，就会生长很多空载的小菌
结果我挑的菌就是卫星菌落

实验室人少没交流，痛苦！...

好像我说的基本是对的,都不赏点金币
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6楼2012-11-10 22:54:55
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titus0805

铁虫 (小有名气)
好像我说的基本是对的,都没有金币打赏
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7楼2012-11-10 22:57:11
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