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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 假阳性克隆的问题

最近一直在做克隆,用的载体是TAKARA的PMD18-T,
克隆的DNA片段1100bp左右,为普通TAQ酶(非保真)扩增。
筛选蓝白斑后挑白斑做PCR快速鉴定很久都检测不到阳性结果(如图),然后听取网友建议将94的预变性时间改为10分钟,侥幸得到2个弱弱的条带,然后挑其他白斑重复均得不到有效结果。非常奇怪、原来做这种克隆一个星期以内绝对会出结果,随便挑斑就能出来。现在怎么这么难,挑了10-20个克隆还不能出现阳性。
弱弱问下各位帮忙分析下可能的原因在哪里?
如果是假阳性问题,那么怎么才能提高转化效率?

另外,一直不得解的是电泳图上方泳道口的带是什么?有人说是蛋白,但是蛋白也能被EB染色吗?

junye pcr.JPG
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titus0805

铁虫 (小有名气)

好像我说的基本是对的,都没有金币打赏
7楼2012-11-10 22:57:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyfgood: 金币+3, 很有用的答案! 2012-11-10 00:39:59
减少假阳性最好的办法就是做克隆时严格控制条件。比方说做连接时你的PCR产物的用量。
此外,菌落PCR模板比较脏,而且量很难控制,点样孔出有些亮是正常现象。被EB染色的不是蛋白,是细菌DNA蛋白复合物。
2楼2012-11-07 14:58:24
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titus0805

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我觉得可能是没转进去。菌长得正常吗?一般氨苄抗性的超过10个小时长出来的菌就不一定是转化进去的了
3楼2012-11-09 09:02:22
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-07 14:58:24
减少假阳性最好的办法就是做克隆时严格控制条件。比方说做连接时你的PCR产物的用量。
此外,菌落PCR模板比较脏,而且量很难控制,点样孔出有些亮是正常现象。被EB染色的不是蛋白,是细菌DNA蛋白复合物。

谢谢,原因找到了,克隆12小时后就要挑菌了,否则时间长了,内酰胺酶会降解氨苄,就会生长很多空载的小菌
结果我挑的菌就是卫星菌落

实验室人少没交流,痛苦!
4楼2012-11-09 20:38:37
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