应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR 溶解曲线乱、ct值高 怎么办
131/2返回列表12下一页
查看: 3277  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

watersr427

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR 溶解曲线乱、ct值高 怎么办

新手一枚，RT-PCR不理想，溶解曲线乱且ct值高，望各位高人指导！感激不尽！
脑组织RNA浓度 样本一：2200ng/ul 260/280 1.84；
样本二：11000ng/ul 260/280 1.94；
样本三：2400ng/ul 260/280 1.87；
第二天，调整浓度至1000ng/ul，逆转录
第三天，扩增
SYBR Premix Ex Taq II 10 ul
PCR Forward Primer 0.8 ul
PCR Reverse Primer 0.8 ul
DNA模版 2.0 ul
dH2O 6.4 ul
Total 20 ul

stage1：95℃ 30s 20℃/s
1 Cycle
stage2：95℃ 5s 20℃/s
62℃ 20s 20℃/s
40 Cycle

内参和目的ct值都在30以上
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-10-19 13:23:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

watersr427

新虫 (初入文坛)
不好意思，补上溶解曲线。望各位指点哈，该怎么办！

PCR 溶解曲线.png
赞一下 回复此楼
2楼2012-10-19 13:25:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
ct在30以上问题并不是很大，虽然比较理想的情况是20-30直接。你的熔解曲线问题很大。熔解温度低的是引物二聚体，温度高的可能有分子量较大其它产物。问一下你做没有做负对照（反转时不加逆转录酶的样品）？样品的A260/280低，有DNA污染。感觉是DNase酶消化没做好。
赞一下 回复此楼
3楼2012-10-19 14:53:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

watersr427

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-19 14:53:16
ct在30以上问题并不是很大，虽然比较理想的情况是20-30直接。你的熔解曲线问题很大。熔解温度低的是引物二聚体，温度高的可能有分子量较大其它产物。问一下你做没有做负对照（反转时不加逆转录酶的样品）？样品的A2 ...

没做过负对照。我是新手很多都不懂，麻烦再问哈，如果DNA污染还有什么方法补救没，因为标本很珍贵呀！
赞一下 回复此楼
4楼2012-10-19 15:41:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by watersr427 at 2012-10-19 15:41:56
没做过负对照。我是新手很多都不懂，麻烦再问哈，如果DNA污染还有什么方法补救没，因为标本很珍贵呀！...

你提的RNA样品定量后重新做DNase消化。消化后做反转录。反转的同时做无反转录酶的对照，做real-time PCR时也跑负对照样品，可以确定样品中是否残留基因组DNA。
赞一下 回复此楼
5楼2012-10-20 06:28:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

watersr427

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-20 06:28:42
你提的RNA样品定量后重新做DNase消化。消化后做反转录。反转的同时做无反转录酶的对照，做real-time PCR时也跑负对照样品，可以确定样品中是否残留基因组DNA。...

非常感谢，我再试试！
赞一下 回复此楼
6楼2012-10-20 22:27:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zyt88

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by watersr427 at 2012-10-19 15:41:56
没做过负对照。我是新手很多都不懂，麻烦再问哈，如果DNA污染还有什么方法补救没，因为标本很珍贵呀！...

你好，我想问一下，反转录时候的无反转录酶对照和定量时的负对照体系里都加什么呢？
赞一下 回复此楼
7楼2012-12-11 21:56:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zyt88

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-20 06:28:42
你提的RNA样品定量后重新做DNase消化。消化后做反转录。反转的同时做无反转录酶的对照，做real-time PCR时也跑负对照样品，可以确定样品中是否残留基因组DNA。...

负对照是以RNA为模板吗？
赞一下 回复此楼
8楼2012-12-11 21:58:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by zyt88 at 2012-12-11 21:58:41
负对照是以RNA为模板吗？...

负对照是指RNA样品反转录合成cDNA时不加酶的样品对照，实际上是RNA。理论上这些样品是没有扩增的。如果RNA里残留有DNA就会批出来。负对照不行的样品不能用，需要重做DNA消化。
赞一下 回复此楼
9楼2012-12-12 07:53:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-12 07:53:15
负对照是指RNA样品反转录合成cDNA时不加酶的样品对照，实际上是RNA。理论上这些样品是没有扩增的。如果RNA里残留有DNA就会批出来。负对照不行的样品不能用，需要重做DNA消化。...

我有个小小的问题，因为ＲＮＡ是及其不稳定的，用没有逆转录的ＲＮＡ作为模板这个时候ＲＮＡ是不是已经降解了呢？
赞一下 回复此楼
keepon
10楼2012-12-12 08:23:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 watersr427 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 297，工科调剂? +5 河南农业大学-能 2026-04-14 5/250 2026-04-18 15:17 by Equinoxhua
[考研] 急需调剂 +9 绝不放弃22 2026-04-15 10/500 2026-04-18 08:09 by chixmc
[考研] 一志愿中科大材料与化工，353分还有调剂学校吗 +10 否极泰来2026 2026-04-15 12/600 2026-04-17 17:54 by mapenggao
[考研] 322求调剂 +6 tekuzu 2026-04-17 6/300 2026-04-17 13:48 by Espannnnnol
[考研] 335求调剂 +20 想上岸呀！！ 2026-04-12 23/1150 2026-04-17 10:50 by cuisz
[考研] 291求调剂 +9 关忆北. 2026-04-14 9/450 2026-04-16 22:49 by cfdbai
[考研] 26药学专硕105500求调剂 +6 喽哈加油 2026-04-13 7/350 2026-04-16 14:31 by zhouxiaoyu
[考研] 322求调剂 +8 123安康 2026-04-12 15/750 2026-04-16 11:07 by Espannnnnol
[考研] 求调剂推荐 +8 小聂爱学习 2026-04-14 8/400 2026-04-16 07:22 by 学员JpLReM
[考研] 085404 22408 309分求调剂 +9 lzmk 2026-04-14 10/500 2026-04-15 20:02 by 学员JpLReM
[考研] 通信工程求调剂！！！ +6 zlb770521 2026-04-14 6/300 2026-04-15 20:00 by 学员JpLReM
[考研] 生物学调剂 +9 纸扇zhishan 2026-04-13 9/450 2026-04-15 18:28 by AN流800
[考研] 310求调剂 +16 666真好 2026-04-11 18/900 2026-04-15 13:28 by 黑科技矿业
[考研] 297工科调剂? +14 河南农业大学-能 2026-04-13 15/750 2026-04-15 13:25 by 黑科技矿业
[考研] 求调剂 +12 何气正 2026-04-13 13/650 2026-04-14 14:47 by zs92450
[考研] 食品与营养（0955）271求调剂 +15 升格阿达 2026-04-12 16/800 2026-04-14 13:18 by 浮若_安生
[考研] 2026硕士调剂_能动_河南农业大学 +4 河南农业大学-能 2026-04-12 4/200 2026-04-13 22:01 by bljnqdcc
[考研] 一志愿中南大学 0855 机械 286 求调剂 +11 不会吃肉 2026-04-12 11/550 2026-04-13 21:59 by bljnqdcc
[考研] 290求调剂 +18 柯淮然 2026-04-12 20/1000 2026-04-13 12:56 by cyh—315
[考研] 344 材料专业 求调剂211 无地域要求 +8 hualkop 2026-04-11 8/400 2026-04-12 22:24 by fqwang
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭