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watersr427

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR 溶解曲线乱、ct值高 怎么办

新手一枚,RT-PCR不理想,溶解曲线乱且ct值高,望各位高人指导!感激不尽!
脑组织RNA浓度 样本一:2200ng/ul 260/280 1.84;
样本二:11000ng/ul 260/280 1.94;
样本三:2400ng/ul 260/280 1.87;
第二天,调整浓度至1000ng/ul,逆转录
第三天,扩增
SYBR Premix Ex Taq II 10 ul
PCR Forward Primer 0.8 ul
PCR Reverse Primer 0.8 ul
DNA模版 2.0 ul
dH2O 6.4 ul
Total 20 ul

stage1:95℃ 30s 20℃/s
1 Cycle
stage2:95℃ 5s 20℃/s
62℃ 20s 20℃/s
40 Cycle

内参和目的ct值都在30以上
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watersr427

新虫 (初入文坛)

不好意思,补上溶解曲线。望各位指点哈,该怎么办!

PCR 溶解曲线.png

2楼2012-10-19 13:25:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
ct在30以上问题并不是很大,虽然比较理想的情况是20-30直接。你的熔解曲线问题很大。熔解温度低的是引物二聚体,温度高的可能有分子量较大其它产物。问一下你做没有做负对照(反转时不加逆转录酶的样品)?样品的A260/280低,有DNA污染。感觉是DNase酶消化没做好。
3楼2012-10-19 14:53:16
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watersr427

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-19 14:53:16
ct在30以上问题并不是很大,虽然比较理想的情况是20-30直接。你的熔解曲线问题很大。熔解温度低的是引物二聚体,温度高的可能有分子量较大其它产物。问一下你做没有做负对照(反转时不加逆转录酶的样品)?样品的A2 ...

没做过负对照。我是新手很多都不懂,麻烦再问哈,如果DNA污染还有什么方法补救没,因为标本很珍贵呀!
4楼2012-10-19 15:41:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by watersr427 at 2012-10-19 15:41:56
没做过负对照。我是新手很多都不懂,麻烦再问哈,如果DNA污染还有什么方法补救没,因为标本很珍贵呀!...

你提的RNA样品定量后重新做DNase消化。消化后做反转录。反转的同时做无反转录酶的对照,做real-time PCR时也跑负对照样品,可以确定样品中是否残留基因组DNA。
5楼2012-10-20 06:28:42
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watersr427

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-20 06:28:42
你提的RNA样品定量后重新做DNase消化。消化后做反转录。反转的同时做无反转录酶的对照,做real-time PCR时也跑负对照样品,可以确定样品中是否残留基因组DNA。...

非常感谢,我再试试!
6楼2012-10-20 22:27:06
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zyt88

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by watersr427 at 2012-10-19 15:41:56
没做过负对照。我是新手很多都不懂,麻烦再问哈,如果DNA污染还有什么方法补救没,因为标本很珍贵呀!...

你好,我想问一下,反转录时候的无反转录酶对照和定量时的负对照体系里都加什么呢?
7楼2012-12-11 21:56:35
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zyt88

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-20 06:28:42
你提的RNA样品定量后重新做DNase消化。消化后做反转录。反转的同时做无反转录酶的对照,做real-time PCR时也跑负对照样品,可以确定样品中是否残留基因组DNA。...

负对照是以RNA为模板吗?
8楼2012-12-11 21:58:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by zyt88 at 2012-12-11 21:58:41
负对照是以RNA为模板吗?...

负对照是指RNA样品反转录合成cDNA时不加酶的样品对照,实际上是RNA。理论上这些样品是没有扩增的。如果RNA里残留有DNA就会批出来。负对照不行的样品不能用,需要重做DNA消化。
9楼2012-12-12 07:53:15
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-12 07:53:15
负对照是指RNA样品反转录合成cDNA时不加酶的样品对照,实际上是RNA。理论上这些样品是没有扩增的。如果RNA里残留有DNA就会批出来。负对照不行的样品不能用,需要重做DNA消化。...

我有个小小的问题,因为RNA是及其不稳定的,用没有逆转录的RNA作为模板这个时候RNA是不是已经降解了呢?
keepon
10楼2012-12-12 08:23:56
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