24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
查看: 3248  |  回复: 12
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

watersr427

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR 溶解曲线乱、ct值高 怎么办

新手一枚,RT-PCR不理想,溶解曲线乱且ct值高,望各位高人指导!感激不尽!
脑组织RNA浓度 样本一:2200ng/ul 260/280 1.84;
样本二:11000ng/ul 260/280 1.94;
样本三:2400ng/ul 260/280 1.87;
第二天,调整浓度至1000ng/ul,逆转录
第三天,扩增
SYBR Premix Ex Taq II 10 ul
PCR Forward Primer 0.8 ul
PCR Reverse Primer 0.8 ul
DNA模版 2.0 ul
dH2O 6.4 ul
Total 20 ul

stage1:95℃ 30s 20℃/s
1 Cycle
stage2:95℃ 5s 20℃/s
62℃ 20s 20℃/s
40 Cycle

内参和目的ct值都在30以上
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zyt88

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by watersr427 at 2012-10-19 15:41:56
没做过负对照。我是新手很多都不懂,麻烦再问哈,如果DNA污染还有什么方法补救没,因为标本很珍贵呀!...

你好,我想问一下,反转录时候的无反转录酶对照和定量时的负对照体系里都加什么呢?
7楼2012-12-11 21:56:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

watersr427

新虫 (初入文坛)

不好意思,补上溶解曲线。望各位指点哈,该怎么办!

PCR 溶解曲线.png

2楼2012-10-19 13:25:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
ct在30以上问题并不是很大,虽然比较理想的情况是20-30直接。你的熔解曲线问题很大。熔解温度低的是引物二聚体,温度高的可能有分子量较大其它产物。问一下你做没有做负对照(反转时不加逆转录酶的样品)?样品的A260/280低,有DNA污染。感觉是DNase酶消化没做好。
3楼2012-10-19 14:53:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

watersr427

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-19 14:53:16
ct在30以上问题并不是很大,虽然比较理想的情况是20-30直接。你的熔解曲线问题很大。熔解温度低的是引物二聚体,温度高的可能有分子量较大其它产物。问一下你做没有做负对照(反转时不加逆转录酶的样品)?样品的A2 ...

没做过负对照。我是新手很多都不懂,麻烦再问哈,如果DNA污染还有什么方法补救没,因为标本很珍贵呀!
4楼2012-10-19 15:41:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 085500求调剂材料 +8 易11122 2026-04-09 8/400 2026-04-09 23:15 by parmtree
[考研] 301求调剂 +5 静静想想 2026-04-05 5/250 2026-04-09 20:58 by 运气yunqi
[考研] 求调剂材料科学与工程一志愿985初试365分 +5 材化李可 2026-04-08 5/250 2026-04-09 17:00 by Lilly_Li
[考研] 311求调剂 +6 surte 2026-04-08 13/650 2026-04-09 14:00 by surte
[考研] 一志愿0807 数一英一 313 有没有二轮调剂 +11 emokidd 2026-04-08 12/600 2026-04-09 09:24 by wyf236
[考研] 266调剂 +8 daya sun 2026-04-07 9/450 2026-04-08 20:27 by yutian743
[考研] 土木水利专硕276分求调剂 +6 我想上学!!6 2026-04-05 9/450 2026-04-08 17:45 by 宋小宝HQ
[考研] 274求调剂求调剂 +10 Jachenbingoo 2026-04-06 13/650 2026-04-08 14:25 by zhq0425
[考研] 388求调剂 +6 四川王涛 2026-04-07 8/400 2026-04-08 00:17 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +4 电气小神童 2026-04-04 6/300 2026-04-07 00:14 by guanxin1001
[考研] 085600,320分求调剂 +16 大馋小子 2026-04-04 17/850 2026-04-06 07:58 by MOF_Catal
[考研] 308求调剂 +3 终不似从前 2026-04-05 3/150 2026-04-05 22:23 by hemengdong
[考研] 085500机械专硕初试288求调剂 +3 GZJguo666- 2026-04-05 3/150 2026-04-05 18:06 by jkddd
[考研] 11408 一志愿西电,277分求调剂 +4 zhouzhen654 2026-04-03 4/200 2026-04-04 18:10 by 猪会飞
[考研] 309求调剂 +4 快乐的小白鸽 2026-04-04 5/250 2026-04-04 15:55 by cql1109
[考研] 085701求调剂 +7 龚禹铭 2026-04-04 8/400 2026-04-04 13:49 by 小小树2024
[考研] 调剂 +5 asdasdassda 2026-04-03 6/300 2026-04-03 20:27 by 岸上的一条鱼
[考研] 338求调剂 +7 晟功? 2026-04-03 7/350 2026-04-03 16:46 by wxiongid
[考研] 0705理学294求调剂 +3 成果成果cg5 2026-04-03 3/150 2026-04-03 14:04 by simons1972
[考研] 材料调剂 +4 一样YWY 2026-04-03 4/200 2026-04-03 09:48 by 蓝云思雨
信息提示
请填处理意见