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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR 溶解曲线乱、ct值高 怎么办
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watersr427

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR 溶解曲线乱、ct值高 怎么办

新手一枚，RT-PCR不理想，溶解曲线乱且ct值高，望各位高人指导！感激不尽！
脑组织RNA浓度 样本一：2200ng/ul 260/280 1.84；
样本二：11000ng/ul 260/280 1.94；
样本三：2400ng/ul 260/280 1.87；
第二天，调整浓度至1000ng/ul，逆转录
第三天，扩增
SYBR Premix Ex Taq II 10 ul
PCR Forward Primer 0.8 ul
PCR Reverse Primer 0.8 ul
DNA模版 2.0 ul
dH2O 6.4 ul
Total 20 ul

stage1：95℃ 30s 20℃/s
1 Cycle
stage2：95℃ 5s 20℃/s
62℃ 20s 20℃/s
40 Cycle

内参和目的ct值都在30以上
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1楼 2012-10-19 13:23:20
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watersr427

新虫 (初入文坛)
不好意思，补上溶解曲线。望各位指点哈，该怎么办！

PCR 溶解曲线.png
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2楼2012-10-19 13:25:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
ct在30以上问题并不是很大，虽然比较理想的情况是20-30直接。你的熔解曲线问题很大。熔解温度低的是引物二聚体，温度高的可能有分子量较大其它产物。问一下你做没有做负对照（反转时不加逆转录酶的样品）？样品的A260/280低，有DNA污染。感觉是DNase酶消化没做好。
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3楼2012-10-19 14:53:16
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watersr427

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-19 14:53:16
ct在30以上问题并不是很大，虽然比较理想的情况是20-30直接。你的熔解曲线问题很大。熔解温度低的是引物二聚体，温度高的可能有分子量较大其它产物。问一下你做没有做负对照（反转时不加逆转录酶的样品）？样品的A2 ...

没做过负对照。我是新手很多都不懂，麻烦再问哈，如果DNA污染还有什么方法补救没，因为标本很珍贵呀！
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4楼2012-10-19 15:41:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by watersr427 at 2012-10-19 15:41:56
没做过负对照。我是新手很多都不懂，麻烦再问哈，如果DNA污染还有什么方法补救没，因为标本很珍贵呀！...

你提的RNA样品定量后重新做DNase消化。消化后做反转录。反转的同时做无反转录酶的对照，做real-time PCR时也跑负对照样品，可以确定样品中是否残留基因组DNA。
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5楼2012-10-20 06:28:42
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watersr427

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-20 06:28:42
你提的RNA样品定量后重新做DNase消化。消化后做反转录。反转的同时做无反转录酶的对照，做real-time PCR时也跑负对照样品，可以确定样品中是否残留基因组DNA。...

非常感谢，我再试试！
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6楼2012-10-20 22:27:06
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zyt88

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by watersr427 at 2012-10-19 15:41:56
没做过负对照。我是新手很多都不懂，麻烦再问哈，如果DNA污染还有什么方法补救没，因为标本很珍贵呀！...

你好，我想问一下，反转录时候的无反转录酶对照和定量时的负对照体系里都加什么呢？
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7楼2012-12-11 21:56:35
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zyt88

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-20 06:28:42
你提的RNA样品定量后重新做DNase消化。消化后做反转录。反转的同时做无反转录酶的对照，做real-time PCR时也跑负对照样品，可以确定样品中是否残留基因组DNA。...

负对照是以RNA为模板吗？
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8楼2012-12-11 21:58:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by zyt88 at 2012-12-11 21:58:41
负对照是以RNA为模板吗？...

负对照是指RNA样品反转录合成cDNA时不加酶的样品对照，实际上是RNA。理论上这些样品是没有扩增的。如果RNA里残留有DNA就会批出来。负对照不行的样品不能用，需要重做DNA消化。
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9楼2012-12-12 07:53:15
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-12 07:53:15
负对照是指RNA样品反转录合成cDNA时不加酶的样品对照，实际上是RNA。理论上这些样品是没有扩增的。如果RNA里残留有DNA就会批出来。负对照不行的样品不能用，需要重做DNA消化。...

我有个小小的问题，因为ＲＮＡ是及其不稳定的，用没有逆转录的ＲＮＡ作为模板这个时候ＲＮＡ是不是已经降解了呢？
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keepon
10楼2012-12-12 08:23:56
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