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ltj1988

铁虫 (初入文坛)

[求助] 蓝白斑筛选后没有目的片段

最近在做重组子的筛选,用的蓝白斑筛选方法,一共做了五个片段的转载,其中三个片段大小在150-200bp,效果都很好;另两个片段大小一个是1100bp左右,另一个是1800bp左右,这两个的平板上也都有白班,但最终的pcr验证却没有想要的片段。五个片段的操作上相同,为什么大片段的就总也转不进去,很费解,求各位高人给分析一下!
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没有白费的辛苦
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chenximutao

金虫 (小有名气)

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感谢参与,应助指数 +1
ltj1988: 金币+1, 有帮助 2012-10-18 18:03:10
提质粒看下转没转进去,有的话酶切验证下~~~
浮尘中的坚持弥足珍贵
2楼2012-10-18 10:56:47
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吴劲松

新虫 (初入文坛)

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感谢参与,应助指数 +1
T载体是连1-2kb的片段是没有什么问题的。可能是载体本身有问题了,或者放得比较久,反复冻融了,连长片段能力会下降比短片段更显著。
生命不息,奋斗不止
3楼2012-10-18 11:22:29
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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感谢参与,应助指数 +1
由于分子量增加,插入大片段要相应增加插入片段的量,以确保载体:插入片段分子数目约为1:3.
4楼2012-10-18 12:15:36
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太极拳

木虫 (小有名气)

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感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-18 18:56:17
T载体转化1K-2K片段应该说很容易,需要保证片段与载体分子数在3:1到5:1之间。另外PCR验证如果没有的话,可以尝试提质粒,然后进行酶切验证,相对比较靠谱!
5楼2012-10-18 16:37:46
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

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感谢参与,应助指数 +1
P不出来的原因很多,也不一定就是没有连上,你可以提质粒酶切验证一下!
持之以恒、永不放弃!
6楼2012-10-18 17:27:29
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zhangby2002

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
按你说的白斑是假阳性的,你PCR产物进行胶回收后,做下电泳吗?你做转化连接时用的载体试剂盒是快连还是连接时间长的,具体操作时是否严谨等。
业精于勤,荒于嬉;行成于思,毁于随。
7楼2012-10-18 17:40:19
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ltj1988

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 吴劲松 at 2012-10-18 11:22:29
T载体是连1-2kb的片段是没有什么问题的。可能是载体本身有问题了,或者放得比较久,反复冻融了,连长片段能力会下降比短片段更显著。

还有这个连接能力下降的原因啊,受益了!
没有白费的辛苦
8楼2012-10-18 18:04:47
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ltj1988

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by zhangby2002 at 2012-10-18 17:40:19
按你说的白斑是假阳性的,你PCR产物进行胶回收后,做下电泳吗?你做转化连接时用的载体试剂盒是快连还是连接时间长的,具体操作时是否严谨等。

做了切胶回收,操作也是按要求来的,已经在改进了。
没有白费的辛苦
9楼2012-10-21 10:11:12
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ltj1988

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 太极拳 at 2012-10-18 16:37:46
T载体转化1K-2K片段应该说很容易,需要保证片段与载体分子数在3:1到5:1之间。另外PCR验证如果没有的话,可以尝试提质粒,然后进行酶切验证,相对比较靠谱!

谢谢,请问您一般怎么确定片段和载体的分子数啊?我们做的时候都是根据他们以往的经验,没有具体计算过,还望指点!
没有白费的辛苦
10楼2012-10-21 10:14:09
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