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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蓝白斑筛选后没有目的片段
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ltj1988

铁虫 (初入文坛)

[求助] 蓝白斑筛选后没有目的片段

最近在做重组子的筛选，用的蓝白斑筛选方法，一共做了五个片段的转载，其中三个片段大小在150-200bp，效果都很好；另两个片段大小一个是1100bp左右，另一个是1800bp左右，这两个的平板上也都有白班，但最终的pcr验证却没有想要的片段。五个片段的操作上相同，为什么大片段的就总也转不进去，很费解，求各位高人给分析一下！
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没有白费的辛苦
1楼 2012-10-18 10:18:17
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chenximutao

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
ltj1988: 金币+1, ★有帮助 2012-10-18 18:03:10
提质粒看下转没转进去，有的话酶切验证下~~~
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浮尘中的坚持弥足珍贵
2楼2012-10-18 10:56:47
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吴劲松

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
T载体是连1－2kb的片段是没有什么问题的。可能是载体本身有问题了，或者放得比较久，反复冻融了，连长片段能力会下降比短片段更显著。
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生命不息，奋斗不止
3楼2012-10-18 11:22:29
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
由于分子量增加，插入大片段要相应增加插入片段的量，以确保载体：插入片段分子数目约为1:3.
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4楼2012-10-18 12:15:36
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-18 18:56:17
T载体转化1K-2K片段应该说很容易，需要保证片段与载体分子数在3：1到5：1之间。另外PCR验证如果没有的话，可以尝试提质粒，然后进行酶切验证，相对比较靠谱！
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5楼2012-10-18 16:37:46
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
P不出来的原因很多，也不一定就是没有连上，你可以提质粒酶切验证一下！
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持之以恒、永不放弃！
6楼2012-10-18 17:27:29
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zhangby2002

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
按你说的白斑是假阳性的，你PCR产物进行胶回收后，做下电泳吗？你做转化连接时用的载体试剂盒是快连还是连接时间长的，具体操作时是否严谨等。
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业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。
7楼2012-10-18 17:40:19
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ltj1988

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 吴劲松 at 2012-10-18 11:22:29
T载体是连1－2kb的片段是没有什么问题的。可能是载体本身有问题了，或者放得比较久，反复冻融了，连长片段能力会下降比短片段更显著。

还有这个连接能力下降的原因啊，受益了！
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没有白费的辛苦
8楼2012-10-18 18:04:47
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ltj1988

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zhangby2002 at 2012-10-18 17:40:19
按你说的白斑是假阳性的，你PCR产物进行胶回收后，做下电泳吗？你做转化连接时用的载体试剂盒是快连还是连接时间长的，具体操作时是否严谨等。

做了切胶回收，操作也是按要求来的，已经在改进了。
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没有白费的辛苦
9楼2012-10-21 10:11:12
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ltj1988

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 太极拳 at 2012-10-18 16:37:46
T载体转化1K-2K片段应该说很容易，需要保证片段与载体分子数在3：1到5：1之间。另外PCR验证如果没有的话，可以尝试提质粒，然后进行酶切验证，相对比较靠谱！

谢谢，请问您一般怎么确定片段和载体的分子数啊？我们做的时候都是根据他们以往的经验，没有具体计算过，还望指点！
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没有白费的辛苦
10楼2012-10-21 10:14:09
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