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lxyyzz木虫 (小有名气)
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富含脯氨酸的蛋白质为什么在进行SDS-PAGE的时候，分子量会比本来的分子量大很多？ 已有1人参与
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RT，求高人解释，SDS-PAGE不是本来剔除了电荷的影响么。 另外，到底什么样的算脯氨酸“富集”？ |
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lxyyzz
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【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+3, 鼓励交流问题 2012-11-09 14:29:43
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1.有可能不是富含脯氨酸的原因 2.上面提到是纯化的蛋白，有没有可能这种蛋白含有较多的半胱氨酸，有可能出现3.的情况 3.在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。 4. 处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。 我也是新手，希望对你有帮助。。。。  |
7楼2012-11-08 19:17:07
lxyyzz
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关于你说的这种情况，我觉得可能有些道理，但是我还有些疑问： 1. 以前有跑过富含半胱氨酸的蛋白质，但是分子量没发现差得很多啊。 2. 关于loading的处理，我们是用DTT做还原剂然后100度煮10min后上样，另外loading里面本来就存在EDTA。没有再补加过。我们实验室一直是这样操作的。 3. 我以前做过一个截短型GST标签的蛋白，加上GST标签实际分子量只有35kDa，但是它脯氨酸含量有些高，80个氨基酸有15个脯氨酸，实际电泳的结果在45kDa，多出来10kDa。我查了下，这80个氨基酸中并没有半胱氨酸。 我仍然觉得确实是脯氨酸的问题，只是不太明白为什么。 欢迎讨论交流！ |
8楼2012-11-09 14:05:14
9楼2013-03-13 17:32:59
lxyyzz
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