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weiyasong

木虫 (著名写手)

[求助] 大家好,帮忙看看PCR结果吧?谢谢!!!

大家好,昨天跑的PCR结果:
1、第3条带大约是多少啊?
2、第4条带的目的片段是187bp,有目的条带,但不是太清楚,而且引物很亮,这是怎么回事啊?PCR反应程序是94℃4min,94℃30s-56℃45s-72℃30s---30个循环,72℃5min

还请高人指教,小弟将不胜感激!谢谢!!!

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weekend883

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你这是上的什么marker啊?p的什么基因啊?说一下呗,这样大家才好帮你分析
2楼2012-09-10 21:46:59
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weiyasong

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by weekend883 at 2012-09-10 21:46:59
你这是上的什么marker啊?p的什么基因啊?说一下呗,这样大家才好帮你分析

DNA 2000 Marker,跑的是细菌DNA
3楼2012-09-10 21:53:12
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merryyiyi

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
weiyasong: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-10 22:08:46
weiyasong: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-11 14:35:26
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-09-11 15:58:00
weiyasong: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-11-13 14:34:39
对于问题一:建议参照marker条带位置(看一下marker的说明书,应该会有对应的每条带长度说明的),以及你设计时候的预期扩增片段长度,结合起来可以估计出第三条带的大小。

对于问题二:应该是你扩增的条件设置不够理想,导致引物二聚体严重。建议提高退火问题,或者是用touchdown(二阶段温度法)的方法(对于上下游引物TM值相差较大的情况)重新扩增,扩增结果应该会有改善。
4楼2012-09-10 22:02:33
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weiyasong

木虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by merryyiyi at 2012-09-10 22:02:33
对于问题一:建议参照marker条带位置(看一下marker的说明书,应该会有对应的每条带长度说明的),以及你设计时候的预期扩增片段长度,结合起来可以估计出第三条带的大小。

对于问题二:应该是你扩增的条件设置不 ...

谢谢!
5楼2012-09-10 22:08:38
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weiyasong

木虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by merryyiyi at 2012-09-10 22:02:33
对于问题一:建议参照marker条带位置(看一下marker的说明书,应该会有对应的每条带长度说明的),以及你设计时候的预期扩增片段长度,结合起来可以估计出第三条带的大小。

对于问题二:应该是你扩增的条件设置不 ...

您好,我的Marker是2000的,我看着条带在750偏下一点,而目的片段是758,那个条带是怎么回事啊?
还有你说的二阶段温度法是什么意思是啊?不太明白,敬请指教!
谢谢!
6楼2012-09-11 09:18:14
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merryyiyi

铜虫 (初入文坛)

从电泳鉴定胶图看,您的扩增条带小于750BP的marker带,建议最好是割胶回收后送测序,用测序结果再与你的预期序列比对,才能确认扩增条带的特异性和扩增引物的特异性。

touchdown(二阶段温度法)的应用比较广泛,你可以按照下面的程序试一下(由你的引物和基因长度来定,注意如果引物TM值较高,那么可以提高起始的65度到68度,再往下每个循环降0.7度),具体实验条件举例见附件

touchdown程序.jpg

7楼2012-09-11 13:30:42
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