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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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fanwww12

铁虫 (初入文坛)

[求助] 酵母提取基因组有几步不懂,求各位帮忙!!!

蜗牛酶反复冻融法提取酵母基因组
1  收集过夜培养16~18h 的菌体1.5mL,加入500μLPBS 溶液重悬菌体,12000r/min 离心2min,用PBS 重洗一次
2  将沉淀溶于35μL 的蜗牛酶溶液中,加入65μL的PBS,45℃作用2h,加100μL 裂解液,- 20℃冷冻,然后室温振荡溶解,反复3 次
3  向悬浮液中加入150μL 5mol/L KAc(pH8.9)轻轻混匀,然后10000r/min 离心5min.
4  取上清液,加入两倍体积的无水乙醇,轻轻混匀,室温放置5min;
5  12000r/min 离心10min,将沉淀溶解在100μL TE 中;加入等体积的酚- 氯仿- 异戊醇(体积比25:24:1),轻柔颠倒混匀,12000r/min 离心5min,
6  重复抽提1 次
7 ,加1/10 体积的3mol/L 醋酸钠(pH5.2),2.5 倍体积的无水乙醇,- 20℃放置30min;
8  10000r/min离心5min,弃上清液,用70% 乙醇溶液洗涤沉淀两次。
9  室温干燥后用20μL TE 溶解;加入0.5μL 10mg/mL 的RNaseA,37℃温浴30min,自然冷却后保存

求解:其中第三步加入150μL 5mol/L KAc(pH8.9)和第四步加入两倍体积的无水乙醇的作用是什么?
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starseacow

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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, 感谢发帖帮助回答问题。 2012-08-07 19:19:41
醋酸钾作用估计是提供一个高盐环境,使DNA上的蛋白质沉淀,通过下面的离心步骤除去。
加两倍体积乙醇,主要是形成约为70%的乙醇溶液。在前面的步骤中,由于高盐存在,往往会形成DNA-阳离子盐,在70%乙醇中,DNA容易沉淀,而盐则较易溶解,这样可以达到纯化沉淀DNA的目的。
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
2楼2012-08-07 18:28:15
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fanwww12

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2012-08-07 18:28:15
醋酸钾作用估计是提供一个高盐环境,使DNA上的蛋白质沉淀,通过下面的离心步骤除去。
加两倍体积乙醇,主要是形成约为70%的乙醇溶液。在前面的步骤中,由于高盐存在,往往会形成DNA-阳离子盐,在70%乙醇中,DNA容易 ...

首先谢谢你的帮助,我们实验第五.六步才是使蛋白质沉淀的,三四两步应该跟沉淀没关系吧!
3楼2012-08-07 20:34:52
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-08 14:19:37
引用回帖:
3楼: Originally posted by fanwww12 at 2012-08-07 20:34:52
首先谢谢你的帮助,我们实验第五.六步才是使蛋白质沉淀的,三四两步应该跟沉淀没关系吧!...

我也有点纠结自己的答案是否正确。貌似酸性醋酸钾溶液才能起到比较好的蛋白沉淀效果;而在楼主的方法中,也没有用到SDS,所以也不需要利用醋酸钾置换钠使SDS沉淀(楼主确定不需要SDS么?)。
另一个猜测,醋酸钾溶液是用于沉淀多糖的?
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
4楼2012-08-07 20:55:27
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