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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酵母提取基因组有几步不懂，求各位帮忙！！！
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fanwww12

铁虫 (初入文坛)

[求助] 酵母提取基因组有几步不懂，求各位帮忙！！！

蜗牛酶反复冻融法提取酵母基因组
1  收集过夜培养16～18h 的菌体1.5mL，加入500μLPBS 溶液重悬菌体，12000r/min 离心2min，用PBS 重洗一次
2  将沉淀溶于35μL 的蜗牛酶溶液中，加入65μL的PBS，45℃作用2h，加100μL 裂解液，－ 20℃冷冻，然后室温振荡溶解，反复3 次
3  向悬浮液中加入150μL 5mol/L KAc(pH8.9)轻轻混匀，然后10000r/min 离心5min.
4  取上清液，加入两倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，室温放置5min；
5  12000r/min 离心10min，将沉淀溶解在100μL TE 中；加入等体积的酚- 氯仿- 异戊醇(体积比25:24:1)，轻柔颠倒混匀，12000r/min 离心5min，
6  重复抽提1 次
7 ，加1/10 体积的3mol/L 醋酸钠(pH5.2)，2.5 倍体积的无水乙醇，－ 20℃放置30min；
8  10000r/min离心5min，弃上清液，用70% 乙醇溶液洗涤沉淀两次。
9  室温干燥后用20μL TE 溶解；加入0.5μL 10mg/mL 的RNaseA，37℃温浴30min，自然冷却后保存

求解：其中第三步加入150μL 5mol/L KAc(pH8.9)和第四步加入两倍体积的无水乙醇的作用是什么？
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1楼 2012-08-07 18:13:59
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 感谢发帖帮助回答问题。 2012-08-07 19:19:41
醋酸钾作用估计是提供一个高盐环境，使DNA上的蛋白质沉淀，通过下面的离心步骤除去。
加两倍体积乙醇，主要是形成约为70%的乙醇溶液。在前面的步骤中，由于高盐存在，往往会形成DNA-阳离子盐，在70%乙醇中，DNA容易沉淀，而盐则较易溶解，这样可以达到纯化沉淀DNA的目的。
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2012-08-07 18:28:15
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fanwww12

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2012-08-07 18:28:15
醋酸钾作用估计是提供一个高盐环境，使DNA上的蛋白质沉淀，通过下面的离心步骤除去。
加两倍体积乙醇，主要是形成约为70%的乙醇溶液。在前面的步骤中，由于高盐存在，往往会形成DNA-阳离子盐，在70%乙醇中，DNA容易 ...

首先谢谢你的帮助，我们实验第五.六步才是使蛋白质沉淀的，三四两步应该跟沉淀没关系吧！
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3楼2012-08-07 20:34:52
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-08 14:19:37
引用回帖:
3楼: Originally posted by fanwww12 at 2012-08-07 20:34:52
首先谢谢你的帮助，我们实验第五.六步才是使蛋白质沉淀的，三四两步应该跟沉淀没关系吧！...

我也有点纠结自己的答案是否正确。貌似酸性醋酸钾溶液才能起到比较好的蛋白沉淀效果；而在楼主的方法中，也没有用到SDS，所以也不需要利用醋酸钾置换钠使SDS沉淀（楼主确定不需要SDS么？）。
另一个猜测，醋酸钾溶液是用于沉淀多糖的？
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
4楼2012-08-07 20:55:27
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