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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求助，换了高保真酶扩不出来目的条带

我的目的产物是3600bp，原来用takara的LA HS可以扩出来，换了东洋纺的KOD Plus Neo怎么也扩不出来，求高手指点
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【分子生物】EPI帖

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1楼 2012-07-01 14:48:59
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励发帖交流！ 2012-07-01 17:47:27
延伸时间要延长，你这两种酶我都没用过，但是一般情况下Taq之类的不保证酶1min最少可以延伸1000bp，pfu等高保真酶只有500~600bp，所以PCR条件也要相应的改变：
如果目的产物3600bp
用普通Taq酶延伸时间至少需要4min左右
用pfu高保真则需要8min左右
希望可以帮到你，祝楼主好运.
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
2楼2012-07-01 15:24:48
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普通回帖

Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2012-07-01 15:24:48
延伸时间要延长，你这两种酶我都没用过，但是一般情况下Taq之类的不保证酶1min最少可以延伸1000bp，pfu等高保真酶只有500~600bp，所以PCR条件也要相应的改变：
如果目的产物3600bp
用普通Taq酶延伸时间至少需要4m ...

打错了几个字是Taq之类的不保真酶
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
3楼2012-07-01 15:25:58
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2012-07-01 15:24:48
延伸时间要延长，你这两种酶我都没用过，但是一般情况下Taq之类的不保证酶1min最少可以延伸1000bp，pfu等高保真酶只有500~600bp，所以PCR条件也要相应的改变：
如果目的产物3600bp
用普通Taq酶延伸时间至少需要4m ...

首先谢谢2楼，以前用的是4分钟，这个酶的说明书上写的是30秒1Kb，所以一开始用的是2分20秒，没出来，又加到4分钟，还是什么都没有
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4楼2012-07-01 15:52:40
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yuzhiming

捐助贵宾 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-02 14:00:44
鱼与熊掌不能兼得。
还是用LA taq，循环数减少。
重复PCR个20个管子。回收目标片段。
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5楼2012-07-01 18:55:13
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yuzhiming at 2012-07-01 18:55:13
鱼与熊掌不能兼得。
还是用LA taq，循环数减少。
重复PCR个20个管子。回收目标片段。

谢谢，这是个不错的建议，主要是前一次用的LA扩的，可能因为循环太多（35个循环），连接到载体里面发生了突变成终止子了，现在也挺害怕突变了，
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6楼2012-07-01 21:22:37
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xiangquanju

金虫 (小有名气)
KOD plus的扩增效率应该蛮高的，你扩增不出来，是什么都没有吗？
可以用做一个退火温度的梯度
还有我们一般都有68°延伸
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7楼2012-07-02 01:52:19
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黄玉红

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我用PFU也扩不出来，目的片段大约2700bp，延伸5min，ITS引物也试了，也扩不出来，我的模板nanodrop检测都是正常的，不知道什么原因，有虫友帮忙分析一下吗
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8楼2012-07-02 02:44:04
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xiangquanju at 2012-07-02 01:52:19
KOD plus的扩增效率应该蛮高的，你扩增不出来，是什么都没有吗？
可以用做一个退火温度的梯度
还有我们一般都有68°延伸

是的，什么都没有，我也很奇怪，我原来用的退火温度就很低了，是51度，当时做的时候就没有再改退火温度，延伸我也是用的68度。
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9楼2012-07-02 08:47:07
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yuzhiming

捐助贵宾 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by anoldhorse at 2012-07-01 21:22:37
谢谢，这是个不错的建议，主要是前一次用的LA扩的，可能因为循环太多（35个循环），连接到载体里面发生了突变成终止子了，现在也挺害怕突变了，...

我的原则是，首先要P出来，然后再保证序列正确，P不出来，再高保真都是浮云。
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10楼2012-07-02 09:03:53
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