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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助，换了高保真酶扩不出来目的条带
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求助，换了高保真酶扩不出来目的条带

我的目的产物是3600bp，原来用takara的LA HS可以扩出来，换了东洋纺的KOD Plus Neo怎么也扩不出来，求高手指点
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1楼2012-07-01 14:48:59
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by Marado at 2012-07-01 15:24:48
延伸时间要延长，你这两种酶我都没用过，但是一般情况下Taq之类的不保证酶1min最少可以延伸1000bp，pfu等高保真酶只有500~600bp，所以PCR条件也要相应的改变：
如果目的产物3600bp
用普通Taq酶延伸时间至少需要4m ...

首先谢谢2楼，以前用的是4分钟，这个酶的说明书上写的是30秒1Kb，所以一开始用的是2分20秒，没出来，又加到4分钟，还是什么都没有
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4楼2012-07-01 15:52:40
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by yuzhiming at 2012-07-01 18:55:13
鱼与熊掌不能兼得。
还是用LA taq，循环数减少。
重复PCR个20个管子。回收目标片段。

谢谢，这是个不错的建议，主要是前一次用的LA扩的，可能因为循环太多（35个循环），连接到载体里面发生了突变成终止子了，现在也挺害怕突变了，
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6楼2012-07-01 21:22:37
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by xiangquanju at 2012-07-02 01:52:19
KOD plus的扩增效率应该蛮高的，你扩增不出来，是什么都没有吗？
可以用做一个退火温度的梯度
还有我们一般都有68°延伸

是的，什么都没有，我也很奇怪，我原来用的退火温度就很低了，是51度，当时做的时候就没有再改退火温度，延伸我也是用的68度。
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9楼2012-07-02 08:47:07
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
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10楼: Originally posted by yuzhiming at 2012-07-02 09:03:53
我的原则是，首先要P出来，然后再保证序列正确，P不出来，再高保真都是浮云。...

精辟！~哈哈
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13楼2012-07-02 15:50:54
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
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11楼: Originally posted by lxlxyc at 2012-07-02 09:20:46
请问一下进行二次PCR了吗？ 如果条带太弱可以进行一下二次PCR

现在是P不出来条带，没得做二次PCR呵呵~
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14楼2012-07-02 15:51:33
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
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12楼: Originally posted by kaikal at 2012-07-02 14:15:17
我觉得2楼说的时间好像有点过长啊！一般pfu高保真酶比taq是要慢点，但是速度没这么慢啊！我觉得时间控制在4-5分钟左右应该差不多，我觉得楼主扩不出来应该不完全是延伸时间的问题，是不是应该做个延伸温度的梯度试一 ...

谢谢哈~以前用takara的LA HS 是可以出来的，现在一点都没啦
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15楼2012-07-02 15:52:54
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
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17楼: Originally posted by kaikal at 2012-07-03 08:56:17
实际上你应该做一下对照，看看是酶的问题还是其他条件需要变动一下，你之前用TAKARA扩出来过，不代表你每次都能扩出来啊！...

酶的问题我也怀疑过，持家基因可以P出来，酶应该没有问题，呵呵
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20楼2012-07-03 09:50:37
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
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21楼: Originally posted by kaikal at 2012-07-03 09:53:26
那你现在有没有用普通酶扩过啊？在相同的体系下，如果不行我觉得你在摸索一下退火温度的条件吧！...

用LA 可以扩出来，做了退火温度梯度还是没有什么成效，真是奇怪的很
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22楼2012-07-03 15:08:33
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