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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求助,换了高保真酶扩不出来目的条带

我的目的产物是3600bp,原来用takara的LA HS可以扩出来,换了东洋纺的KOD Plus Neo怎么也扩不出来,求高手指点
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by yuzhiming at 2012-07-01 18:55:13
鱼与熊掌不能兼得。
还是用LA taq,循环数减少。
重复PCR个20个管子。回收目标片段。

谢谢,这是个不错的建议,主要是前一次用的LA扩的,可能因为循环太多(35个循环),连接到载体里面发生了突变成终止子了,现在也挺害怕突变了,
6楼2012-07-01 21:22:37
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励发帖交流! 2012-07-01 17:47:27
延伸时间要延长,你这两种酶我都没用过,但是一般情况下Taq之类的不保证酶1min最少可以延伸1000bp,pfu等高保真酶只有500~600bp,所以PCR条件也要相应的改变:
如果目的产物3600bp
用普通Taq酶延伸时间至少需要4min左右
用pfu高保真则需要8min左右
希望可以帮到你,祝楼主好运.
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
2楼2012-07-01 15:24:48
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2012-07-01 15:24:48
延伸时间要延长,你这两种酶我都没用过,但是一般情况下Taq之类的不保证酶1min最少可以延伸1000bp,pfu等高保真酶只有500~600bp,所以PCR条件也要相应的改变:
如果目的产物3600bp
用普通Taq酶延伸时间至少需要4m ...

打错了几个字是Taq之类的不保真酶
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
3楼2012-07-01 15:25:58
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2012-07-01 15:24:48
延伸时间要延长,你这两种酶我都没用过,但是一般情况下Taq之类的不保证酶1min最少可以延伸1000bp,pfu等高保真酶只有500~600bp,所以PCR条件也要相应的改变:
如果目的产物3600bp
用普通Taq酶延伸时间至少需要4m ...

首先谢谢2楼,以前用的是4分钟,这个酶的说明书上写的是30秒1Kb,所以一开始用的是2分20秒,没出来,又加到4分钟,还是什么都没有
4楼2012-07-01 15:52:40
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