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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助，换了高保真酶扩不出来目的条带
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kaikal

银虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by anoldhorse at 2012-07-03 09:50:37
酶的问题我也怀疑过，持家基因可以P出来，酶应该没有问题，呵呵...

那你现在有没有用普通酶扩过啊？在相同的体系下，如果不行我觉得你在摸索一下退火温度的条件吧！
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加油！！！
21楼2012-07-03 09:53:26
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
21楼: Originally posted by kaikal at 2012-07-03 09:53:26
那你现在有没有用普通酶扩过啊？在相同的体系下，如果不行我觉得你在摸索一下退火温度的条件吧！...

用LA 可以扩出来，做了退火温度梯度还是没有什么成效，真是奇怪的很
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22楼2012-07-03 15:08:33
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sd3824289

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-04 13:48:50
高保真酶虽然错配率很低，但是他的效率不高，我也遇到过这个问题，建议楼主用普通Taq酶和高保真酶混合使用，这样效果会比较些！个人建议！
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
23楼2012-07-03 15:41:39
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kaikal

银虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by anoldhorse at 2012-07-03 15:08:33
用LA 可以扩出来，做了退火温度梯度还是没有什么成效，真是奇怪的很...

那你看看的KOD酶会不会有问题啊！还有就是镁离子浓度在摸索一下！
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加油！！！
24楼2012-07-04 07:16:12
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-07-04 13:49:06
我之前做PCR也碰到过相似的问题。最后发现是酶的问题。
开始是1min 1kb，后来换了5s 1kb的就P不出来的。酶的速度太快对稍微长一点基因片段要求就会很高。
所以还是用回原来的酶吧，时间少了，可是P不出来那也是没有用的啊~
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25楼2012-07-04 10:57:11
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biobiobio

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

首先LA是普通taq酶，不要再当作高保真酶使用了，如果你有高保真的要求的话，用它不突变就怪了，KOD是高保真酶，扩增能力本来就会比普通Taq低，所 以你这种情况也就没什么奇怪了，你可以再试试其他高保真，phanta 猛药，兼具高保真和很强的扩增能力，速度很快，还有phusion也不错，都可以尝试
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26楼2012-11-26 21:46:23
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
引用回帖:
8楼: Originally posted by 黄玉红 at 2012-07-02 02:44:04
我用PFU也扩不出来，目的片段大约2700bp，延伸5min，ITS引物也试了，也扩不出来，我的模板nanodrop检测都是正常的，不知道什么原因，有虫友帮忙分析一下吗

pfu按照说明书操作就行了，模板引物没有问题，还是扩不出来找厂家帮忙。。。
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
27楼2015-07-22 16:30:52
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