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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助，换了高保真酶扩不出来目的条带
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lxlxyc

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
请问一下进行二次PCR了吗？ 如果条带太弱可以进行一下二次PCR
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11楼2012-07-02 09:20:46
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kaikal

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得2楼说的时间好像有点过长啊！一般pfu高保真酶比taq是要慢点，但是速度没这么慢啊！我觉得时间控制在4-5分钟左右应该差不多，我觉得楼主扩不出来应该不完全是延伸时间的问题，是不是应该做个延伸温度的梯度试一下，换酶之后有的时候温度会有2-3度的变化的吧！不行的话我觉得你应该用普通酶做个对照，相同的条件下看看普通酶能不能扩增出来！
祝楼主实验顺利啊！
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加油！！！
12楼2012-07-02 14:15:17
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by yuzhiming at 2012-07-02 09:03:53
我的原则是，首先要P出来，然后再保证序列正确，P不出来，再高保真都是浮云。...

精辟！~哈哈
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13楼2012-07-02 15:50:54
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by lxlxyc at 2012-07-02 09:20:46
请问一下进行二次PCR了吗？ 如果条带太弱可以进行一下二次PCR

现在是P不出来条带，没得做二次PCR呵呵~
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14楼2012-07-02 15:51:33
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by kaikal at 2012-07-02 14:15:17
我觉得2楼说的时间好像有点过长啊！一般pfu高保真酶比taq是要慢点，但是速度没这么慢啊！我觉得时间控制在4-5分钟左右应该差不多，我觉得楼主扩不出来应该不完全是延伸时间的问题，是不是应该做个延伸温度的梯度试一 ...

谢谢哈~以前用takara的LA HS 是可以出来的，现在一点都没啦
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15楼2012-07-02 15:52:54
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xiangquanju

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by anoldhorse at 2012-07-02 08:47:07
是的，什么都没有，我也很奇怪，我原来用的退火温度就很低了，是51度，当时做的时候就没有再改退火温度，延伸我也是用的68度。...

我也用KOD plus扩过，我的引物退货温度不是很好，相差比较大，一个60，一个40，我设置的梯度在35到50之间，都扩增出来了，在高一点就可以！还有就是引物的浓度，一定不要太高了
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16楼2012-07-03 00:47:22
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kaikal

银虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by anoldhorse at 2012-07-02 15:52:54
谢谢哈~以前用takara的LA HS 是可以出来的，现在一点都没啦 ...

实际上你应该做一下对照，看看是酶的问题还是其他条件需要变动一下，你之前用TAKARA扩出来过，不代表你每次都能扩出来啊！
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加油！！！
17楼2012-07-03 08:56:17
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
换takara的LA taq或者EX Taq都是高保真的
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仕不可不弘毅，任重而道远
18楼2012-07-03 09:33:53
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Jane_618

银虫 (初入文坛)
顶顶顶顶顶~~~~~~~~~~~~
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19楼2012-07-03 09:49:06
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by kaikal at 2012-07-03 08:56:17
实际上你应该做一下对照，看看是酶的问题还是其他条件需要变动一下，你之前用TAKARA扩出来过，不代表你每次都能扩出来啊！...

酶的问题我也怀疑过，持家基因可以P出来，酶应该没有问题，呵呵
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20楼2012-07-03 09:50:37
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