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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求助,换了高保真酶扩不出来目的条带

我的目的产物是3600bp,原来用takara的LA HS可以扩出来,换了东洋纺的KOD Plus Neo怎么也扩不出来,求高手指点
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kaikal

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我觉得2楼说的时间好像有点过长啊!一般pfu高保真酶比taq是要慢点,但是速度没这么慢啊!我觉得时间控制在4-5分钟左右应该差不多,我觉得楼主扩不出来应该不完全是延伸时间的问题,是不是应该做个延伸温度的梯度试一下,换酶之后有的时候温度会有2-3度的变化的吧!不行的话我觉得你应该用普通酶做个对照,相同的条件下看看普通酶能不能扩增出来!
祝楼主实验顺利啊!
加油!!!
12楼2012-07-02 14:15:17
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励发帖交流! 2012-07-01 17:47:27
延伸时间要延长,你这两种酶我都没用过,但是一般情况下Taq之类的不保证酶1min最少可以延伸1000bp,pfu等高保真酶只有500~600bp,所以PCR条件也要相应的改变:
如果目的产物3600bp
用普通Taq酶延伸时间至少需要4min左右
用pfu高保真则需要8min左右
希望可以帮到你,祝楼主好运.
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
2楼2012-07-01 15:24:48
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2012-07-01 15:24:48
延伸时间要延长,你这两种酶我都没用过,但是一般情况下Taq之类的不保证酶1min最少可以延伸1000bp,pfu等高保真酶只有500~600bp,所以PCR条件也要相应的改变:
如果目的产物3600bp
用普通Taq酶延伸时间至少需要4m ...

打错了几个字是Taq之类的不保真酶
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
3楼2012-07-01 15:25:58
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2012-07-01 15:24:48
延伸时间要延长,你这两种酶我都没用过,但是一般情况下Taq之类的不保证酶1min最少可以延伸1000bp,pfu等高保真酶只有500~600bp,所以PCR条件也要相应的改变:
如果目的产物3600bp
用普通Taq酶延伸时间至少需要4m ...

首先谢谢2楼,以前用的是4分钟,这个酶的说明书上写的是30秒1Kb,所以一开始用的是2分20秒,没出来,又加到4分钟,还是什么都没有
4楼2012-07-01 15:52:40
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