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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助，换了高保真酶扩不出来目的条带
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求助，换了高保真酶扩不出来目的条带

我的目的产物是3600bp，原来用takara的LA HS可以扩出来，换了东洋纺的KOD Plus Neo怎么也扩不出来，求高手指点
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1楼 2012-07-01 14:48:59
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xiangquanju at 2012-07-02 01:52:19
KOD plus的扩增效率应该蛮高的，你扩增不出来，是什么都没有吗？
可以用做一个退火温度的梯度
还有我们一般都有68°延伸

是的，什么都没有，我也很奇怪，我原来用的退火温度就很低了，是51度，当时做的时候就没有再改退火温度，延伸我也是用的68度。
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9楼2012-07-02 08:47:07
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励发帖交流！ 2012-07-01 17:47:27
延伸时间要延长，你这两种酶我都没用过，但是一般情况下Taq之类的不保证酶1min最少可以延伸1000bp，pfu等高保真酶只有500~600bp，所以PCR条件也要相应的改变：
如果目的产物3600bp
用普通Taq酶延伸时间至少需要4min左右
用pfu高保真则需要8min左右
希望可以帮到你，祝楼主好运.
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2楼2012-07-01 15:24:48
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2012-07-01 15:24:48
延伸时间要延长，你这两种酶我都没用过，但是一般情况下Taq之类的不保证酶1min最少可以延伸1000bp，pfu等高保真酶只有500~600bp，所以PCR条件也要相应的改变：
如果目的产物3600bp
用普通Taq酶延伸时间至少需要4m ...

打错了几个字是Taq之类的不保真酶
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3楼2012-07-01 15:25:58
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anoldhorse

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2012-07-01 15:24:48
延伸时间要延长，你这两种酶我都没用过，但是一般情况下Taq之类的不保证酶1min最少可以延伸1000bp，pfu等高保真酶只有500~600bp，所以PCR条件也要相应的改变：
如果目的产物3600bp
用普通Taq酶延伸时间至少需要4m ...

首先谢谢2楼，以前用的是4分钟，这个酶的说明书上写的是30秒1Kb，所以一开始用的是2分20秒，没出来，又加到4分钟，还是什么都没有
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4楼2012-07-01 15:52:40
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