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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 切胶回收后片段不单一的原因
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yingyangyang

木虫 (正式写手)

[求助] 切胶回收后片段不单一的原因已有1人参与

我用2%琼脂糖凝胶跑电泳，切胶回收300-400bp的片段，然后用胶纯化试剂盒纯化回收的片段，再跑个电泳，结果出现了两条带，有300-400bp片段和400bp以上一条带！做了多次都这样，不知道为什么？？？确定准确的切300-400的片段，不可能切刀400以上的，但是多次做都是这样的结果！ 为什么呢？？试剂盒也没有污染！求解。。。以下是切胶回收后的电泳图！！有两条带！


[ Last edited by yingyangyang on 2012-6-25 at 12:48 ]
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1楼2012-06-25 12:47:18
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dingxiuying

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 很热心，很中肯的建议 2012-06-25 13:48:01
可能原因：
1、试剂盒有污染。
2、回收试剂有问题.
解决办法：
1、不用试剂盒回收纯化，用自己配制的试剂。
2、做二次回收。
3、将胶浓度再加大，跑胶时间加长，尽量让条带分得开一些。
4、换一种marker，尽量使切胶的位置更准确些。
5、实在没办法就把所有用到的试剂都重新配制。
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我喜欢默默地被你注视默默地注视着你，我喜欢深深地被你爱着深深地爱着你
2楼2012-06-25 13:23:45
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windsor2011

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是回收条带的纯度不高，可尝试一下在回收时将胶切的更碎一些，并加大溶胶液的量，也许效果会好一些
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只要功夫深铁杵磨成针
3楼2012-06-26 10:44:49
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yingyangyang

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dingxiuying at 2012-06-25 13:23:45
可能原因：
1、试剂盒有污染。
2、回收试剂有问题.
解决办法：
1、不用试剂盒回收纯化，用自己配制的试剂。
2、做二次回收。
3、将胶浓度再加大，跑胶时间加长，尽量让条带分得开一些。
4、换一种marker，尽 ...

胶纯化的试剂怎么配置呢？有具体的配方吗？没有自己配过呢！
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4楼2012-06-27 18:22:14
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yingyangyang

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by windsor2011 at 2012-06-26 10:44:49
是回收条带的纯度不高，可尝试一下在回收时将胶切的更碎一些，并加大溶胶液的量，也许效果会好一些

我是加3陪体积的QG溶的。用的是低熔点的琼脂糖胶，不用切碎溶的挺彻底的。这个会影响条带么？
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5楼2012-06-27 18:24:02
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lyweichen

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是电泳缓冲液要换了？2%gel高吗？我们通常用的是1%的gel。你的胶图发黄是什么个情况，而且Marker也有拖尾。
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6楼2012-06-27 19:30:18
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lyweichen

铁虫 (小有名气)
我用过天根和Qigen的试剂盒，都可以。通常我切胶回收后直接做连接，呵呵，楼主细心！
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7楼2012-06-27 19:34:12
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sk_yb

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
试剂盒的问题，我也经常遇到不合格的试剂盒。换一批就又好了。基本上不会是你操作的问题。何况有重复试验。
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8楼2012-06-27 20:44:10
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dingxiuying

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by yingyangyang at 2012-06-27 18:22:14
胶纯化的试剂怎么配置呢？有具体的配方吗？没有自己配过呢！...

查查分子克隆方面的书吧，上面有。
现在一般都用试剂盒了。
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我喜欢默默地被你注视默默地注视着你，我喜欢深深地被你爱着深深地爱着你
9楼2012-06-28 12:13:30
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jqq1985

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

会不会是电泳缓冲有污染，或者其他溶液有污染？
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10楼2012-06-28 13:50:06
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