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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大家帮我看看啊，我做的酶切反应到底是怎么回事呢？急急急！
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weiguo2889

木虫 (小有名气)

[求助] 大家帮我看看啊，我做的酶切反应到底是怎么回事呢？急急急！

这是我酶切的电泳图，用的是全基因组DNA，反应体系如下（体系是参考别人的）：我想得到的是200-1000bp左右的片段         
            Genomic DNA            20μl (5-6μg)
            10×enzyme buffer    5μl (终浓度1×)
             Sau3AI                      2μl（10U/μl）
             ddH2O                       23μl         
             Total Volume        50μl
然后 37℃酶切2-3hr，结果就是这样了，这是我没纯化的总DNA做的，我纯化后做的更是一点条带都没有，到底是怎么回事啊？
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1楼 2012-06-07 11:40:26
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hongqifei

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-07 22:52:43
DNA全都降解了。先确认一下是不是DNA本身已经降解，再看看内切酶或反应体系有没有问题。
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weiguo2889
何须剑道争锋？千人指，万人封，可问江湖鼎峰，三尺秋水尘不染，天下无双。
2楼2012-06-07 11:52:07
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weiguo2889

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hongqifei at 2012-06-07 11:52:07
DNA全都降解了。先确认一下是不是DNA本身已经降解，再看看内切酶或反应体系有没有问题。

但是我检测了提出的gDNA的啊，虽然有部分降解，但是还是有完整的，我觉得全部降解应该不是很可能吧，哎，这个反应体系是参考的别人博士论文里面的方法，内切酶也是在生工订的
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3楼2012-06-07 12:04:51
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一申二心

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-08 13:51:14
你的这个结果好像是酶切出来。建议首先检测DNA，然后用不存在讲解问题的再做一下，还有在考虑是不是酶的添加量有问题
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weiguo2889
4楼2012-06-07 14:04:42
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weiguo2889

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 一申二心 at 2012-06-07 14:04:42
你的这个结果好像是酶切出来。建议首先检测DNA，然后用不存在讲解问题的再做一下，还有在考虑是不是酶的添加量有问题

我提的基因组DNA一般都会有部分降解，因为材料的原因，但是我前几天将DNA纯化回收了以后再做酶切反应还是没有目的条带。酶加多了会出现这种结果？
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5楼2012-06-07 15:01:08
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一申二心

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by weiguo2889 at 2012-06-07 15:01:08
我提的基因组DNA一般都会有部分降解，因为材料的原因，但是我前几天将DNA纯化回收了以后再做酶切反应还是没有目的条带。酶加多了会出现这种结果？...

是不是DNA的浓度过低啊？或者是没得添加量少了
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6楼2012-06-07 21:53:53
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elbo

金虫 (小有名气)
建议酶切之前GDNA进行纯化，另外酶切时间弄到3小时以上，生工的酶是进口分装的，他们的说明书 很粗糙，用的时候打了很多电话。
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weiguo2889
7楼2012-06-08 07:19:44
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suifeng91

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议如下：
1、应该加一个没有酶切的基因组DNA样品；
2、Sau3AI 是四碱基识别内切酶，所以理论上256bp就有一个酶切位点。部分酶切的时候酶量及酶切时间要优化。
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weiguo2889
人生不是一场物质的盛宴，而是一次灵魂的修炼，使它在谢幕之时比开幕之初更为高尚。
8楼2012-06-08 14:55:37
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weiguo2889

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by suifeng91 at 2012-06-08 14:55:37
建议如下：
1、应该加一个没有酶切的基因组DNA样品；
2、Sau3AI 是四碱基识别内切酶，所以理论上256bp就有一个酶切位点。部分酶切的时候酶量及酶切时间要优化。

恩，谢谢你了哦！
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9楼2012-06-09 00:44:16
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weiguo2889

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by elbo at 2012-06-08 07:19:44
建议酶切之前GDNA进行纯化，另外酶切时间弄到3小时以上，生工的酶是进口分装的，他们的说明书 很粗糙，用的时候打了很多电话。

谢谢你了，呵呵~
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10楼2012-06-09 00:44:36
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