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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PAGE跑PCR产物总是有问题~~
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yuyitt

新虫 (初入文坛)

[求助] PAGE跑PCR产物总是有问题~~

我PCR出一段具有高度变异性的片段，类似于16s rDNA，长度分别为250bp(+-20bp)及 186bp(+-20bp),PCR产物跑1.5%琼脂糖没有任何问题，但是分辨率不高，因此想跑PAGE胶查看下是否正确，但是PAGE胶跑出来却是如下，很奇怪很奇怪，这尾巴拉的太长了吧。PAGE条件是70V，1.5h，8%胶。
下面是2个PAGE图：


但是跑琼脂糖电泳就没有问题，下面是琼脂糖胶：



[ Last edited by yuyitt on 2012-5-28 at 20:54 ]
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1楼 2012-05-28 20:53:13
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cxb-abc

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-28 21:59:08
你用什么染得色？PAGE胶的银染效果有没有试过？
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2楼2012-05-28 21:14:11
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cxb-abc

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你用什么染得色？PAGE胶的银染效果有没有试过？
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3楼2012-05-28 21:16:14
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yuyitt

新虫 (初入文坛)
西瓜: 回帖置顶 2012-05-28 21:59:20
引用回帖:
2楼: Originally posted by cxb-abc at 2012-05-28 21:14:11
你用什么染得色？PAGE胶的银染效果有没有试过？

sybr green I染色的。
关键是，marker没有任何问题，没有一点拖尾，但是PCR产物就有拖尾，很奇怪
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4楼2012-05-28 21:23:23
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yuyitt

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cxb-abc at 2012-05-28 21:16:14
你用什么染得色？PAGE胶的银染效果有没有试过？

银染还没有试过 ，但是奇怪的是我的结果marker就没有问题，而且条带最下面的分界线很清楚，就是我需要的片段大小。。。。
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5楼2012-05-29 08:49:33
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cxb-abc

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yuyitt at 2012-05-28 21:23:23
sybr green I染色的。
关键是，marker没有任何问题，没有一点拖尾，但是PCR产物就有拖尾，很奇怪...

琼脂糖胶拉不开距离，page胶是可以的，你P的过程中，条件有没有换？比如试剂，PCR仪？不一个批次的试剂效果不一样，不一样的PCR仪P的效果也不一样。
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6楼2012-05-29 20:39:07
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yuyitt

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cxb-abc at 2012-05-29 20:39:07
琼脂糖胶拉不开距离，page胶是可以的，你P的过程中，条件有没有换？比如试剂，PCR仪？不一个批次的试剂效果不一样，不一样的PCR仪P的效果也不一样。...

如果有一点拖尾我觉得会很正常啊，但是这个本来230-270bp 的片段却跑出230-500多的条带，也有点太离谱了。。晕死了，我同一批样，从来没有换过仪器。
今天有个同学说page胶跑DNA的时候DNA都会大量残留于加样孔，据说有专门的loading buffer，但是我却没有查到这个，另外我查《精编分子生物实验手册》看到，如果有蛋白质的话，蛋白质-DNA相互作用会阻碍DNA的电泳。不着调具体是咋样的。
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7楼2012-05-30 15:51:43
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hyc_charles

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by yuyitt at 2012-05-30 15:51:43
如果有一点拖尾我觉得会很正常啊，但是这个本来230-270bp 的片段却跑出230-500多的条带，也有点太离谱了。。晕死了，我同一批样，从来没有换过仪器。
今天有个同学说page胶跑DNA的时候DNA都会大量残留于加样孔，据 ...

我做的是植物总DNA，后续也有PAGE胶检测扩增产物，没有出现所谓的DNA残留在空中，之所以用loading buffer之类的缓冲液是为了让样品点在胶孔的底部，不会上漂，是的跑出来的条带整齐美观而已
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不但要做一个优秀的人，更要做一个无可取代的人…
8楼2013-07-22 19:13:38
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xz2001199802

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以试试用跟高浓度的琼脂糖凝胶，并减少上样量，于marker相比你加的明显多了，
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越学越无知
9楼2013-07-22 20:45:35
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白杨柳

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

为什么在点样空这么多残留物？应该不是DNA吧
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前进吧
10楼2013-10-25 17:43:45
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