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[求助]
【SOS】EcoRI单酶切连接不上
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各位大侠，求助！ 目的片段3000bp,在PCR时两端均加上EcoRI酶切位点，PCR后，连接全式金的pEASY-T1-Simple载体，没问题。载体是整合载体YIP5，由于酶切位点的限制，只有EcoRI可以与我的目的片段连接。YIP5是7000多bp,由于已经插入了一个基因，所以现在是9000多bp。 目的基因用EcoRI从T载体上切下来，切得还不错，切胶用OMEGA胶回收30微升。载体用EcoRI酶切4个小时，跑电泳看条带切得也不错，回收后，用NEB的CIP去磷酸化处理，37℃，1个小时，CIP加了0.3微升，跑胶回收。 连接时，载体加1微升，目的片段7微升，Fermentas连接酶0.5微升，22℃，1个小时，转化TOP10。长出来不到十个菌落，菌落PCR全不对。我也尝试过用未经过磷酸化处理的载体与目的片段连接，长出很多，菌落PCR也不多。折腾有快3个月了，就是连不上。快要疯了。跪求求各位帮忙！！！ |
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