应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【SOS】EcoRI单酶切连接不上
141/2返回列表12下一页
查看: 2228  |  回复: 13
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
【悬赏金币】回答本帖问题，作者构质粒ING将赠送您 4 个金币

构质粒ING

新虫 (初入文坛)

[求助] 【SOS】EcoRI单酶切连接不上

各位大侠，求助！
    目的片段3000bp,在PCR时两端均加上EcoRI酶切位点，PCR后，连接全式金的pEASY-T1-Simple载体，没问题。载体是整合载体YIP5，由于酶切位点的限制，只有EcoRI可以与我的目的片段连接。YIP5是7000多bp,由于已经插入了一个基因，所以现在是9000多bp。
      目的基因用EcoRI从T载体上切下来，切得还不错，切胶用OMEGA胶回收30微升。载体用EcoRI酶切4个小时，跑电泳看条带切得也不错，回收后，用NEB的CIP去磷酸化处理，37℃，1个小时，CIP加了0.3微升，跑胶回收。
    连接时，载体加1微升，目的片段7微升，Fermentas连接酶0.5微升，22℃，1个小时，转化TOP10。长出来不到十个菌落，菌落PCR全不对。我也尝试过用未经过磷酸化处理的载体与目的片段连接，长出很多，菌落PCR也不多。折腾有快3个月了，就是连不上。快要疯了。跪求求各位帮忙！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2012-05-28 10:46:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

构质粒ING

新虫 (初入文坛)
西瓜: 回帖置顶 2012-05-28 22:00:07
引用回帖:
4楼: Originally posted by 547star at 2012-05-28 12:26:18
从你的描述看,建议还是去磷酸化处理载体,转化出来的菌落少,就要全部提取质粒再做酶切或PCR鉴定，DNA片段浓度我也经常没电泳看浓度，不过克隆遇到困难，可以尝试不同体积比的连接。转化的时候，尝试加不同的量的，比 ...

谢谢你的回复。
    载体去磷酸化后，只长出来2、3个，最多5个，做菌落PCR都没有条带，一跑电泳什么都没有，就是最下边有引物二聚体。那这种情况下，也有必要提它们的质粒做酶切鉴定么？
赞一下 回复此楼
7楼2012-05-28 17:31:06
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

547star

木虫 (著名写手)
★ ★
西瓜: 金币+2, Good！ 2012-05-28 22:00:19
连接有假阳性,假阴性,菌落PCR受到比较多因素影响，在那么久都没有得到目的克隆的情况下，提质粒再PCR或酶切，会有助于排除问题。转化得到的菌落少，还可以考虑重新制备感受态细胞。
赞一下(1人) 回复此楼
为什么
10楼2012-05-28 21:01:48
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
构质粒ING: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-05-28 11:41:24
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-28 15:58:51
你有没有提过质粒看看，从你长出来的菌里提的质粒跟你载体比是不是一样大小，或者是比你载体还小？你载体很大，又回收了两次，我怀疑你载体是不是断的比较多。我们实验室载体7000bp的都有很多断的情况。
你可以把你磷酸化处理好的载体做一个阴性对照，看你载体处理的如何，如果阴性对照都长很多的话，那说明你载体处理的不好。
连接的时候片段还可以加多一些。
呵呵，希望你成功。
赞一下 回复此楼
未来不是梦
2楼2012-05-28 10:59:16
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

构质粒ING

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-28 10:59:16
你有没有提过质粒看看，从你长出来的菌里提的质粒跟你载体比是不是一样大小，或者是比你载体还小？你载体很大，又回收了两次，我怀疑你载体是不是断的比较多。我们实验室载体7000bp的都有很多断的情况。
你可以把你 ...

谢谢你的帮助。
    有几次菌落PCR有条带，摇菌提质粒就发现小了，小到只有4000多bp了。那看来是断裂了。您说把磷酸化的载体做阴性对照的意思，是把处理过的载体也转化TOP10么？
    由于我们实验室不能测片段的浓度，所以每次都是估算。我一直是1：7连接。   您的意思是加大连接片段是么？    多谢多谢！！
赞一下 回复此楼
3楼2012-05-28 11:08:39
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-28 15:59:00
从你的描述看,建议还是去磷酸化处理载体,转化出来的菌落少,就要全部提取质粒再做酶切或PCR鉴定，DNA片段浓度我也经常没电泳看浓度，不过克隆遇到困难，可以尝试不同体积比的连接。转化的时候，尝试加不同的量的，比如100微升感受态细胞加1-10微升，多做几次会成功的。
赞一下 回复此楼
为什么
4楼2012-05-28 12:26:18
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜: 金币+2, 说得好呢 2012-05-28 22:00:01
引用回帖:
3楼: Originally posted by 构质粒ING at 2012-05-28 11:08:39
谢谢你的帮助。
    有几次菌落PCR有条带，摇菌提质粒就发现小了，小到只有4000多bp了。那看来是断裂了。您说把磷酸化的载体做阴性对照的意思，是把处理过的载体也转化TOP10么？
    由于我们实验室不能测片段的 ...

阴性对照就是让你的载体去连接，然后转化TOP10，看看长不长，连接的时候可以多加片段，尽量多加。
不过首先得把载体处理好，载体处理不好连接肯定还是困难。你去磷酸化后可以酚仿抽提回收，不用胶回收试剂盒看看，断的会不会少一些。
赞一下 回复此楼
未来不是梦
5楼2012-05-28 14:16:29
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wk990240

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-28 15:59:14
载体酶切回收后，自连反应，然后转化，看长的斑的多少，如果长的很多，说明处理不完全，你再和你片段进行连接反应时，大部分就会是载体自连的，这样显然连接效率不够高，我一般都是载体酶切消化8个小时以上，然后回收载体。检测自连效果的，并且跟目的片段连时，片段一定要多加，载体只要处理的比如好。很少就OK了。
赞一下 回复此楼
6楼2012-05-28 14:31:15
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

构质粒ING

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-28 14:16:29
阴性对照就是让你的载体去连接，然后转化TOP10，看看长不长，连接的时候可以多加片段，尽量多加。
不过首先得把载体处理好，载体处理不好连接肯定还是困难。你去磷酸化后可以酚仿抽提回收，不用胶回收试剂盒看看， ...

那做载体阴性对照的时候，还用把载体加T4连接酶连接吗？还是说直接把处理过载体转化TOP10？
赞一下 回复此楼
8楼2012-05-28 17:39:35
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

构质粒ING

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wk990240 at 2012-05-28 14:31:15
载体酶切回收后，自连反应，然后转化，看长的斑的多少，如果长的很多，说明处理不完全，你再和你片段进行连接反应时，大部分就会是载体自连的，这样显然连接效率不够高，我一般都是载体酶切消化8个小时以上，然后回 ...

您指的自连反应，是把酶切过的载体直接转化么？还用加T4连接酶吗？
赞一下 回复此楼
9楼2012-05-28 17:41:16
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 构质粒ING 的主题更新
141/2返回列表12下一页
不应助 确定回帖应助 (注意：应助才可能被奖励，但不允许灌水，必须填写15个字符以上)
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 要持续整治滥发“帽子”、“牌子”之风 +5 babu2015 2024-06-25 5/250 2024-06-26 10:29 by vmuch520
[有机交流] 做什么表征可以检测塑料中碳氢氧的含量 5+3 pzr的sci之路 2024-06-25 5/250 2024-06-26 10:13 by zqdsb
[有机交流] 酚羟基甲基化 10+4 A好运来啦啦啦 2024-06-25 6/300 2024-06-26 10:08 by 88817753
[有机交流] 大佬们，打的核磁氢谱与chemdraw预测的有偏差 +4 来了个 2024-06-26 4/200 2024-06-26 10:00 by 88817753
[基金申请] 今天能不能出来名单 +8 地理学1995 2024-06-25 10/500 2024-06-26 09:46 by msjy
[硕博家园] 联培博士文章第一单位署名问题交流~ +8 橙成成c 2024-06-23 19/950 2024-06-26 09:32 by 091602
[有机交流] 大佬们，打的核磁氢谱与chemdraw预测的有偏差 +4 来了个 2024-06-26 4/200 2024-06-26 08:45 by czyzsu
[基金申请] 厅级项目出校却没中 +13 Iwould 2024-06-23 20/1000 2024-06-26 06:14 by foolishmani
[基金申请] 这样的说辞是上会了吗 +12 学员d3zYCz 2024-06-24 15/750 2024-06-25 22:05 by 3115321
[考博] 没读上博，好焦虑！ +6 wangzhe_bs 2024-06-24 8/400 2024-06-25 21:15 by wangzhe_bs
[基金申请] 博后面上到底什么时候出结果？？？ +7 爱学lsy 2024-06-24 7/350 2024-06-25 19:24 by 暴走的蒜泥
[基金申请] 能看出是否上会了吗 +10 articlefan 2024-06-23 15/750 2024-06-25 16:05 by 请慎重修改昵称
[基金申请] 博后面上今天下午会公布吗？大家有无消息？ +9 地理学1995 2024-06-24 12/600 2024-06-25 14:09 by guoguo0119
[基金申请] 演员杨幂在核心期刊发表论文，中国广播电视学期刊 +9 babu2015 2024-06-22 12/600 2024-06-25 11:05 by 我是勇敢牛牛
[教师之家] 复旦夏同学提出高校成年人学生退学不应该让家长审核，大家认同吗？ +10 苏东坡二世 2024-06-22 17/850 2024-06-24 16:52 by wanghuawei
[金属] 寻找钛合金热压缩代做 +4 liuyang358 2024-06-23 4/200 2024-06-24 13:50 by 搬砖狗不放弃
[基金申请] b口yq上会情况 +5 XUAAAAA 2024-06-19 6/300 2024-06-24 01:13 by sunrise3148
[论文投稿] OSA期刊审稿逾期 +3 Thomas_Squid 2024-06-22 3/150 2024-06-23 15:20 by wspglt
[基金申请] 面上博士后 +11 jsqy 2024-06-19 13/650 2024-06-21 17:12 by sizhouyi
[论文投稿] ACS 编辑的意见 10+3 哈哈妞1993 2024-06-20 3/150 2024-06-21 17:06 by 投个论文
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭