| 查看: 2268 | 回复: 13 | ||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者构质粒ING将赠送您 4 个金币 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
【SOS】EcoRI单酶切连接不上
|
||
|
各位大侠，求助！ 目的片段3000bp,在PCR时两端均加上EcoRI酶切位点，PCR后，连接全式金的pEASY-T1-Simple载体，没问题。载体是整合载体YIP5，由于酶切位点的限制，只有EcoRI可以与我的目的片段连接。YIP5是7000多bp,由于已经插入了一个基因，所以现在是9000多bp。 目的基因用EcoRI从T载体上切下来，切得还不错，切胶用OMEGA胶回收30微升。载体用EcoRI酶切4个小时，跑电泳看条带切得也不错，回收后，用NEB的CIP去磷酸化处理，37℃，1个小时，CIP加了0.3微升，跑胶回收。 连接时，载体加1微升，目的片段7微升，Fermentas连接酶0.5微升，22℃，1个小时，转化TOP10。长出来不到十个菌落，菌落PCR全不对。我也尝试过用未经过磷酸化处理的载体与目的片段连接，长出很多，菌落PCR也不多。折腾有快3个月了，就是连不上。快要疯了。跪求求各位帮忙！！！ |
回复此楼» 猜你喜欢
请教脂质体包裹miRNA
已经有0人回复
-
磷酸酚酯合成
已经有1人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有275人回复
-
三氯氧磷跟酚
已经有1人回复
-
关于举办2024年化工制药与材料类优秀大学生暑期夏令营的通知
已经有0人回复
-
M9培养基浑浊
已经有1人回复
-
面上评审意见-帮忙看一下等级（没上会）
已经有76人回复
-
目的基因序列中有多个引物插入
已经有1人回复
-
链霉亲和素磁珠偶联biotin修饰分子好还是点击反应偶联分子好？
已经有0人回复
-
磁珠法纯化蛋白相比层析柱有什么优势？
已经有2人回复
-
磁固相萃取在药物分析中有潜在应用价值吗？
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 如何导将ApaI酶切位点变成EcoRI
已经有8人回复
- 关于EcoRI的部分酶切
已经有15人回复
- AFLP酶切连接 求高人指点啊
已经有11人回复
- DNA双酶切后在两端加adapter的连接问题
已经有7人回复
- 求助！请问 NdeI 和EcoRI 同时做酶切可以吗？
已经有3人回复
- 质粒单酶切出现两条带
已经有18人回复
- 求，原核表达相关问题？
已经有12人回复
- 琼脂糖凝胶电泳相关知识
已经有117人回复
- 【求助/交流】请教关于pPIC9K EcoRI 单酶切
已经有3人回复
- 【求助/交流】为什么pUC18和DNA片段经过Eco1和Hind3酶切后无法连接
已经有3人回复
- 【求助/交流】ECORI酶切反应体系体积可加大吗
已经有6人回复
- 【求助/交流】超大片段连接问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】4kb片段的连接
已经有14人回复
- 【求助/交流】单酶切连接的克隆急……
已经有10人回复
- 【求助/交流】载体酶切连接结果分析（附图） ！！！
已经有7人回复
张宏宇123
金虫 (著名写手)
- 应助: 52 (初中生)
- 金币: 388.9
- 帖子: 1084
- 在线: 93.8小时
- 虫号: 1766866
- 注册: 2012-04-20
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
2楼2012-05-28 10:59:16
张宏宇123
金虫 (著名写手)
- 应助: 52 (初中生)
- 金币: 388.9
- 帖子: 1084
- 在线: 93.8小时
- 虫号: 1766866
- 注册: 2012-04-20
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
5楼2012-05-28 14:16:29
张宏宇123
金虫 (著名写手)
- 应助: 52 (初中生)
- 金币: 388.9
- 帖子: 1084
- 在线: 93.8小时
- 虫号: 1766866
- 注册: 2012-04-20
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
12楼2012-05-29 09:43:25
30