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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 黄孢子原毛平革菌木素过氧化物酶，锰过氧化物酶，漆酶酶活测定
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fanxiaojuan

金虫 (小有名气)

[交流] 黄孢子原毛平革菌木素过氧化物酶，锰过氧化物酶，漆酶酶活测定

我用的方法如下：
    木素过氧化物酶（LiP）测定：取 0.2mL 藜芦醇溶液（10mmol•L-1）、0.4mL 酒石酸缓冲液（250mmol•L-1，pH=3.0）与 0.4mL 粗酶液混匀，即得 1mL 反应液。在 30℃下，于反应液中加 20μLH2O2溶液（20mmol•L-1）启动酶促反应，以未加启动因子的反应液为参比，用紫外分光光度计（UV-2550）测定 310nm 处 2min 前后反应液吸光度的变化。一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化藜芦醇产生 1μmol藜芦醛所需的酶量。
    锰过氧化物酶（MnP）测定：将 0.2113g MnSO4溶解于 1L 酒石酸缓冲液（50mmol•L-1，pH=4.5）中，取 0.8mL 该溶液同 0.2mL 粗酶液混匀，即得 1mL 反应液。在 30℃下，于反应液中加 20μLH2O2溶液（20mmol•L-1）启动酶促反应，以未加启动因子的反应液为参比，用紫外分光光度计（UV-2550）测定 290nm 处2min 前后反应液吸光度的变化。一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化 Mn2+产生 1μmol Mn3+所需的酶量。
    漆酶采用ABTS法
但测出吸光度是负值，请大家帮忙分析一下并提出宝贵意见，还有不解的是怎么把吸光度的变化转化为酶活，还有就是测定2min钟前后的吸光度变化，这两分钟怎么选取，随便选取两分钟即可吗，或者大家有没有测这几种酶的具体方法，能否分享一下，拜托各位了！

[ Last edited by fanxiaojuan on 2012-5-17 at 17:05 ]
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1楼2012-05-17 17:02:11
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方林明

铁杆木虫 (正式写手)
（最常用的）漆酶活力测定方法——愈创木酚法
50mmol/L琥珀酸钠为缓冲液（pH4.5），在10mL反应混合液中含0.04mmol愈创木酚和1mL粗酶液，30℃反应30min后，于465nm处测定吸光度。以灭活的酶液反应混合液为对照。
注意事项：
a 底物愈创木酚用95%乙醇溶解，使1mL乙醇中溶有0.04mmol愈创木酚，即4.5μL
b 50mmol/L琥珀酸钠缓冲液（pH4.5）的配制方法：称取NaOH1g，琥珀酸5.9g，溶于蒸馏水800mL，然后用1mmol/L的NaOH溶液调pH至4.5,定容至1000mL
c 反应体系：
1mL 95%乙醇（溶有0.04mmol愈创木酚）+1mL粗酶液+8mL琥珀酸钠缓冲液
d 酶液灭活方法：沸水浴中2——5分钟
粗酶液制备
发酵液经7200r/min离心，上清液即为粗酶液。酶活高时用琥珀酸钠缓冲溶液适当稀释。
酶活单位定义:
1min内催化氧化1nmol愈创木酚的酶量为1个酶活单位（U）。
酶活计算公式:
酶活（U/mL）=10的6次方* V总*ΔA/(V酶*ε*Δt)                      （式1）
其中V总、V酶分别代表反应体系的总体积及反应酶液的体积
ε为吸光系数，愈创木酚的ε465=1.21×104mol-1?L?cm-1)
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S姗姗来迟S
20楼2012-05-17 19:33:14
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xiao7270

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanxiaojuan: 金币+1, 有帮助 2012-05-18 14:16:04
1. 测定波长在紫外区的时候用石英比色皿，可见光区用玻璃比色皿。
2. 仪器调零用纯水，对照组应该是缓冲液。
3. 测定的液体里面有没有气泡？无论是对照还是样品的液体里有气泡就会严重影响测定结果，出负数还是小状况。
4. 混匀你的样品和对照，液体不匀时也有可能出负数。
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30楼2012-05-18 12:27:32
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Jjprepared

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶活我是第一次测，来这里交流交流。
LiP没测过，
漆酶我是按照文献里有从最开始测的吸光度，每隔10秒测一下，直到2min。
MnP我想请教一下，我看文献里有用酚红和硫酸锰测的，吸光值在610nm处，不知道和楼主方法差别大不大？
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49楼2013-04-01 19:39:02
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zx610137541

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你好  我刚开始做黄孢原毛平革菌，还在菌种活化阶段，请问该菌在斜面上的菌落形态和颜色是怎样的呀？谢啦
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50楼2014-07-24 09:39:27
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普通回帖

yangy1220

新虫 (职业作家)
★
fanxiaojuan(金币+1): 谢谢参与
祝福楼主
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2楼2012-05-17 17:48:22
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yangy1220

新虫 (职业作家)
★
fanxiaojuan(金币+1): 谢谢参与
祝福楼主
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3楼2012-05-17 17:48:32
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yuanyeguhong

至尊木虫 (文坛精英)
★
fanxiaojuan(金币+1): 谢谢参与
得金币了，说声谢谢！
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13楼2012-05-17 19:05:12
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啄虫鸟

新虫 (著名写手)
★
fanxiaojuan(金币+1): 谢谢参与
闲来逛逛……
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14楼2012-05-17 19:09:05
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捡金小儿

新虫 (著名写手)
★
fanxiaojuan(金币+1): 谢谢参与
谢谢楼主！
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17楼2012-05-17 19:13:14
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方林明

铁杆木虫 (正式写手)
★
fanxiaojuan(金币+1): 谢谢参与
ABTS ——分光光度计法

以ABTS 为底物测定漆酶酶活是目前国外最为常见的方法之一。它有如下优点： (1) ABTS 易溶于水，在室温下放置6 个月仍较稳定。 (2) 其反应只有一步，即从ABTS 到它的阳离子自由基。ABTS 的阳离子自由基在水溶液中呈浅蓝绿色，且比较稳定，通常在几个小时或几天之内是稳定的。 (3) 在漆酶的作用下，ABTS 有色溶液的摩尔吸光系数较高，说明以其为底物测定的灵敏度较高。 (4) 到目前为止，还未有报道称ABTS 有致癌作用、诱变作用或是强烈的毒性。 Wolfenden and Wilson 分别对5 mmol/ L ABTS加入20μmol/ L 的抗坏血酸盐的测定溶液，于不同波长进行了光谱扫描，发现纯ABTS 呈浅蓝绿色，且在415 nm 处有吸收峰；而加了抗坏血酸盐的溶液为无色，在415 nm 处无吸收峰。

ABTS 的最大吸收峰在340 nm ，ABTS 的阳离子自由基的最大吸收峰在415 nm. 由此推断，在ABTS 的溶液中含有极少的ABTS 阳离子自由基，它们在更强的还原剂作用下被还原为ABTS。以ABTS 为底物进行漆酶的定量分析，通常在420 nm 下测定3 min 内吸光度的变化。用这种底物进行定量分析有一个缺点，即ABTS 阳离子自由基溶液的吸光度受溶液中未反应的ABTS 浓度的影响。 这就产生了一个问题：420 nm 下的摩尔吸光系数36 000 L/ (mol?cm) 是在纯ABTS 阳离子自由基的条件下求得的，而在实际测定反应中，ABTS 是过量的，这就导致人们低估了酶活。 这种影响不能忽视，因为反应终止时，溶液中至少还要有1 mmol/ L的ABTS。尽管用ABTS 为底物存在上述问题，但是它仍是漆酶酶活测定的最佳底物之一。一般以ABTS 为底物，采用Glycine2HCl 缓冲体系、乙酸2乙酸钠缓冲体系或柠檬酸盐2磷酸盐缓冲体系。如果菌种产生过氧化氢，为了准确测定，需加入一定量的过氧化氢酶，用以破坏过氧化氢。因为在代谢过程中，菌体自身产生过氧化氢可激发木质素过氧化物酶与锰过氧化物酶对ABTS 的氧化。
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louchunxia
18楼2012-05-17 19:29:56
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方林明

铁杆木虫 (正式写手)
★
fanxiaojuan(金币+1): 谢谢参与
漆酶最适 p H 值的测定方法 在 25 ℃时，以 2mLBritton2Robinson 缓冲溶液，外加 1 mL 用蒸馏水稀释 104 倍的漆酶液为空白；先设定参数，使吸光度自动归零。取 1 mL 相应 pH 值的Britton2Robinson 缓冲溶液，用蒸馏水 1 mL 稀释104 倍的漆酶液 ，再加 1 mL 的 1 mmol/ L AB TS 溶液于比色皿启动反应，同时用 UV - 2201 型紫外 - 可见分光光度计的 TIME2COURSE 程序记录吸光度在420 nm 波长处 4 min 内的时间历程 ，取该曲线最初部分的斜率为酶反应的速度，酶反应速度最大时对应的 pH 值为漆酶的最适 pH 值。

查文献知漆酶酶活最适pH为4.5。 3.3.1.3 漆酶稀释倍数及酶活力的测定方法 取酶液0.1ml，加入Hac-NaAc（pH4.5）缓冲液2.5ml，混匀，加入ABTS0.4ml，放置30s，每15s读取一次420nm下吸光值。共读取6～7个数值。以经验判断，若吸光值增长迅速，则将酶液稀释2～5倍再次测定，直至吸光值数值变化不是太快，且数值均在0.2～0.8之间。酶活的计算：吸光度变化的斜率×4000×稀释倍数。
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19楼2012-05-17 19:31:49
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fanxiaojuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by 方林明 at 2012-05-17 19:33:14:
（最常用的）漆酶活力测定方法——愈创木酚法
50mmol/L琥珀酸钠为缓冲液（pH4.5），在10mL反应混合液中含0.04mmol愈创木酚和1mL粗酶液，30℃反应30min后，于465nm处测定吸光度。以灭活的酶液反应混合液为对照。
...

这个我也见过，请问你做过吗？
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21楼2012-05-17 20:49:17
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方林明

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by fanxiaojuan at 2012-05-17 20:49:17:
这个我也见过，请问你做过吗？

经常做，交流交流
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22楼2012-05-17 21:11:02
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xxnly

金虫 (小有名气)
★ ★
fanxiaojuan(金币+1): 谢谢参与
fanxiaojuan: 金币+1 2012-05-18 10:50:44
木素过氧化物酶（LiP）测定那里 ，标准曲线呢？对照标准曲线求出生成多少μmol藜芦醛，除以反应时间，再换算成每毫升或者升，酶活力的单位应该是    μmol/mL这样的吧
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23楼2012-05-17 21:11:02
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xxnly

金虫 (小有名气)
★
fanxiaojuan(金币+1): 谢谢参与
第二个同理。吸光度是负值，可能跟你调零那里放的东西配制有关系，也许配浓了，也许是样品的活性小……
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24楼2012-05-17 21:13:24
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fanxiaojuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 方林明 at 2012-05-17 21:11:02:
经常做，交流交流

亲人呐~~~~~经常做漆酶的吗，用的哪种方法？怎么把吸光度转化为酶活呢？
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louchunxia
25楼2012-05-18 10:49:28
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fanxiaojuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by xxnly at 2012-05-17 21:11:02:
木素过氧化物酶（LiP）测定那里 ，标准曲线呢？对照标准曲线求出生成多少μmol藜芦醛，除以反应时间，再换算成每毫升或者升，酶活力的单位应该是    μmol/mL这样的吧

我觉得也需要标准曲线呢，但不会做哦，又找不到具体的方法，请问你可有具体的方法吗？不胜感激
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26楼2012-05-18 10:52:41
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fanxiaojuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by xxnly at 2012-05-17 21:11:02:
木素过氧化物酶（LiP）测定那里 ，标准曲线呢？对照标准曲线求出生成多少μmol藜芦醛，除以反应时间，再换算成每毫升或者升，酶活力的单位应该是    μmol/mL这样的吧

有理，请问知不知道那反应的2min怎么选取，随便选取吗？
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27楼2012-05-18 11:00:31
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方林明

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
25楼: Originally posted by fanxiaojuan at 2012-05-18 10:49:28:
亲人呐~~~~~经常做漆酶的吗，用的哪种方法？怎么把吸光度转化为酶活呢？

你做哪方面
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28楼2012-05-18 11:17:22
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xxnly

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanxiaojuan: 金币+2, 谢谢你的热心帮助，很有帮助 2012-05-18 14:18:08
引用回帖:
26楼: Originally posted by fanxiaojuan at 2012-05-18 10:52:41:
我觉得也需要标准曲线呢，但不会做哦，又找不到具体的方法，请问你可有具体的方法吗？不胜感激

产物是藜芦醛，应该是配制藜芦醛溶液，按照你的反应体系，把底物和酶的部分换成一系列浓度的藜芦醛溶液，在要求的条件下测定应该就可以了。关于标准溶液的配制和梯度设计，很多书上都有。

反应的2min那里，因为做了没有启动反应的对照，用启动反应的实验组藜芦醛产量减去没有启动反应的藜芦醛量就可以了。反应时间就是2分钟，即在加入启动剂之后计时2min后可以测了吧。或者是在反应之前测定吸光度，反应2min后再测一次，但是这个不是很好控制。

有时候中文文献不是很可靠，可以综合几个文献看看相关实验方法，或者看看英文文献之类的。试验中如果发现文献中有错误你可以自己纠正自己一步步揣摩。酶的测定方法很多都是底物和产物反应，测定生成物的吸光度这样，多看看文献。你这个实验我也没做过，只是按照一般的思路分析而已，可能说的不对，还请你多包涵。
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31楼2012-05-18 13:17:24
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fanxiaojuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
28楼: Originally posted by 方林明 at 2012-05-18 11:17:22:
你做哪方面

黄孢原毛平革菌固体发酵测酶活
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32楼2012-05-18 14:15:36
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方林明

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
32楼: Originally posted by fanxiaojuan at 2012-05-18 14:15:36:
黄孢原毛平革菌固体发酵测酶活

你跟从哪位高人？
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35楼2012-05-18 17:37:23
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fanxiaojuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
35楼: Originally posted by 方林明 at 2012-05-18 17:37:23:
你跟从哪位高人？

跟的老板不是做这方面的，所以我表示很吃力，可否指导一下》？
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36楼2012-05-19 11:39:58
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骑猪看日出

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanxiaojuan: 金币+2, 好的，谢谢哦 2012-05-19 18:18:23
我们实验室常用的方法，这是师姐论文上用的。我还没有做过，具体操作部是很清楚，不过听说这东西测出来参差不齐的，兄台好好摸索吧，祝你成功，相互交流。
1.漆酶(Lac)活性的测定
        于0.05mol/LpH4.0的醋酸缓冲液3.5ml中，加入3.36mmol/L的邻联甲苯胺0.5ml(95%的乙醇溶液)，再加入稀释50倍的酶液0.5ml，30℃反应3min后于600nm处比色测定。酶定义为每分钟每毫升使OD600值改变0.001为一个酶活力单位。
2.木质素过氧化物酶(Lip)活性的测定
亚甲基蓝法:0.1ml的1.2mmol/L的亚甲基蓝，0.6ml的0.5mol/L的酒石酸钠缓冲成分，（PH4.0），2.2ml稀释50倍的酶液，加0.1ml的2.7mmol/的H2O2启动反应。酶定义为每分钟每毫升使OD664值改变0.001为一个酶活力单位。
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37楼2012-05-19 17:25:44
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a且歌且行a

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanxiaojuan: 金币+2 2012-05-21 14:06:01
漆酶酶活测定：
以愈创木酚为底物，3mL反应混合液中，含50mmol/L琥珀酸钠缓冲液（pH=4.5），1mmol/L底物和0.6mL粗酶液（发酵液经10000 r/min离心10min后取上清液作为粗酶液），30℃水浴保温反应30min后，于465nm处测定吸光度。以酶液事先灭活的反应混合液为对照，酶活定义：以1min内催化氧化1μmol愈创木酚的量为1个酶活单位（U）。
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38楼2012-05-20 21:29:42
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fanxiaojuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
38楼: Originally posted by a且歌且行a at 2012-05-20 21:29:42:
漆酶酶活测定：
以愈创木酚为底物，3mL反应混合液中，含50mmol/L琥珀酸钠缓冲液（pH=4.5），1mmol/L底物和0.6mL粗酶液（发酵液经10000 r/min离心10min后取上清液作为粗酶液），30℃水浴保温反应30min后，于465nm处

这个要做标线吧，标线怎么做呢，是以愈创木酚坐标线吗？
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39楼2012-05-21 14:07:20
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a且歌且行a

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
根据酶活公式将吸光度转化为酶活。我是以酶稀释倍数的倒数代替酶的浓度作的标线。查阅文献似乎找不到合理方法，只能如此。
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40楼2012-05-21 21:32:26
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guohaixin

木虫 (小有名气)
★
fanxiaojuan: 金币+1 2012-07-19 17:19:49
顶起楼主~
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41楼2012-07-18 09:51:34
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jely1987

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
一般吸光度的检测都是从0开始逐渐增大的，但是ABTS法不是的，最原始的原理是要首先配制吸光度在0.7的溶液，添加物质之后，吸光度减小，也就是说，你如果设置之前的样品为空白的话（0.7吸光度），添加物质之后的吸光度作为样品减去空白，肯定是负值，你把负号去掉即可了
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42楼2012-07-21 18:48:39
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1509118638

铜虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请求那位高人能否告诉我测定锰过氧化物酶和木素过氧化物酶的计算公式，吸光值怎样转换成酶活？先受小妹一拜，不胜感激！
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43楼2012-08-10 16:45:54
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晒晒月亮

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
有哪位高人用Azure B法测定木质素过氧化物酶、用酚红法测定锰过氧化物酶的，具体做法是什么，求教，谢谢！
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44楼2012-08-10 22:03:43
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1509118638

铜虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请求那位高人能否告诉我测定锰过氧化物酶和木素过氧化物酶的计算公式，吸光值怎样转换成酶活？先受小妹一拜，不胜感激!邮箱：shhuang@soil.gd.cn
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45楼2012-08-11 17:09:08
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1509118638

铜虫 (正式写手)
我也正准备做呢，也不知道计算公式，我看有些文献就是以每分钟增加0.1个OD值为一个单位的，外文文献应该有，楼主如知道了请发给我知，谢谢！shhuang@soil.gd.cn
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46楼2012-08-12 16:52:28
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S姗姗来迟S

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送鲜花一朵
引用回帖:
20楼: Originally posted by 方林明 at 2012-05-17 19:33:14
（最常用的）漆酶活力测定方法——愈创木酚法
50mmol/L琥珀酸钠为缓冲液（pH4.5），在10mL反应混合液中含0.04mmol愈创木酚和1mL粗酶液，30℃反应30min后，于465nm处测定吸光度。以灭活的酶液反应混合液为对照。
注 ...

您好！我想问下酶活计算公式中的10的6次方的意义是什么？是固定常数吗？
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47楼2012-08-30 19:41:32
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20楼: Originally posted by 方林明 at 2012-05-17 19:33:14
（最常用的）漆酶活力测定方法——愈创木酚法
50mmol/L琥珀酸钠为缓冲液（pH4.5），在10mL反应混合液中含0.04mmol愈创木酚和1mL粗酶液，30℃反应30min后，于465nm处测定吸光度。以灭活的酶液反应混合液为对照。
注 ...

我在文献里看的方法和你的大致相同：10 mL反应体系中, 含 50 mmol L- 1琥珀酸钠缓冲溶液(pH 值4. 5) , 0. 4 mmol L- 1的愈创木酚和0. 5 mL的酶液, 30℃条件下反应30 min 后, 于465 nm 处测OD 值.酶活力定义为: 以灭活的酶液反应混合物做对照, 1 min 内催化氧化1 nmoL 愈创木酚的酶量为1 U。
    文献里愈创木酚的浓度配比不一样，而且没有说各个溶液加入的体积是多少。还有就是反应时间到底按30min算还是1mi算。
    酶活单位定义:1min内催化氧化1nmol愈创木酚的酶量为1个酶活单位（U）。1nmol的话是不是要乘以10的9次方，也是我在文献里看到的。《木质素降解相关酶类测定标准方法研究》
    发现不同文献里测LiP、MnP、Lac的方法都略有不同，自己测的酶活也是乱七八糟，忽大忽小，十分郁闷……求大神解惑指导
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48楼2013-03-25 10:38:56
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