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fanxiaojuan

金虫 (小有名气)

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[交流] 黄孢子原毛平革菌木素过氧化物酶，锰过氧化物酶，漆酶酶活测定

我用的方法如下：
木素过氧化物酶（LiP）测定：取 0.2mL 藜芦醇溶液（10mmol•L-1）、0.4mL 酒石酸缓冲液（250mmol•L-1，pH=3.0）与 0.4mL 粗酶液混匀，即得 1mL 反应液。在 30℃下，于反应液中加 20μLH2O2溶液（20mmol•L-1）启动酶促反应，以未加启动因子的反应液为参比，用紫外分光光度计（UV-2550）测定 310nm 处 2min 前后反应液吸光度的变化。一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化藜芦醇产生 1μmol藜芦醛所需的酶量。
锰过氧化物酶（MnP）测定：将 0.2113g MnSO4溶解于 1L 酒石酸缓冲液（50mmol•L-1，pH=4.5）中，取 0.8mL 该溶液同 0.2mL 粗酶液混匀，即得 1mL 反应液。在 30℃下，于反应液中加 20μLH2O2溶液（20mmol•L-1）启动酶促反应，以未加启动因子的反应液为参比，用紫外分光光度计（UV-2550）测定 290nm 处2min 前后反应液吸光度的变化。一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化 Mn2+产生 1μmol Mn3+所需的酶量。
漆酶采用ABTS法
但测出吸光度是负值，请大家帮忙分析一下并提出宝贵意见，还有不解的是怎么把吸光度的变化转化为酶活，还有就是测定2min钟前后的吸光度变化，这两分钟怎么选取，随便选取两分钟即可吗，或者大家有没有测这几种酶的具体方法，能否分享一下，拜托各位了！

[ Last edited by fanxiaojuan on 2012-5-17 at 17:05 ]

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1楼 2012-05-17 17:02:11

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方林明

铁杆木虫 (正式写手)

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★
fanxiaojuan(金币+1): 谢谢参与

ABTS ——分光光度计法

以ABTS 为底物测定漆酶酶活是目前国外最为常见的方法之一。它有如下优点： (1) ABTS 易溶于水，在室温下放置6 个月仍较稳定。 (2) 其反应只有一步，即从ABTS 到它的阳离子自由基。ABTS 的阳离子自由基在水溶液中呈浅蓝绿色，且比较稳定，通常在几个小时或几天之内是稳定的。 (3) 在漆酶的作用下，ABTS 有色溶液的摩尔吸光系数较高，说明以其为底物测定的灵敏度较高。 (4) 到目前为止，还未有报道称ABTS 有致癌作用、诱变作用或是强烈的毒性。 Wolfenden and Wilson 分别对5 mmol/ L ABTS加入20μmol/ L 的抗坏血酸盐的测定溶液，于不同波长进行了光谱扫描，发现纯ABTS 呈浅蓝绿色，且在415 nm 处有吸收峰；而加了抗坏血酸盐的溶液为无色，在415 nm 处无吸收峰。

ABTS 的最大吸收峰在340 nm ，ABTS 的阳离子自由基的最大吸收峰在415 nm. 由此推断，在ABTS 的溶液中含有极少的ABTS 阳离子自由基，它们在更强的还原剂作用下被还原为ABTS。以ABTS 为底物进行漆酶的定量分析，通常在420 nm 下测定3 min 内吸光度的变化。用这种底物进行定量分析有一个缺点，即ABTS 阳离子自由基溶液的吸光度受溶液中未反应的ABTS 浓度的影响。这就产生了一个问题：420 nm 下的摩尔吸光系数36 000 L/ (mol?cm) 是在纯ABTS 阳离子自由基的条件下求得的，而在实际测定反应中，ABTS 是过量的，这就导致人们低估了酶活。这种影响不能忽视，因为反应终止时，溶液中至少还要有1 mmol/ L的ABTS。尽管用ABTS 为底物存在上述问题，但是它仍是漆酶酶活测定的最佳底物之一。一般以ABTS 为底物，采用Glycine2HCl 缓冲体系、乙酸2乙酸钠缓冲体系或柠檬酸盐2磷酸盐缓冲体系。如果菌种产生过氧化氢，为了准确测定，需加入一定量的过氧化氢酶，用以破坏过氧化氢。因为在代谢过程中，菌体自身产生过氧化氢可激发木质素过氧化物酶与锰过氧化物酶对ABTS 的氧化。