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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 综合其他 » 植物山茶过氧化氢酶（CAT）活性测定问题
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senlinpeiyu

铜虫 (小有名气)

[求助] 植物山茶过氧化氢酶（CAT）活性测定问题已有2人参与

1、过氧化氢酶（CAT）活性测定
（1）试剂配制：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4•12H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4•2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.15mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。
（2）反应液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）摇匀即可。
（3）酶液制备：取0.1g（因为叶片非常少，取了0.1g的样）叶片，洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。酶液提取出来后，当天没有测定，于是把酶液保存在4度冰箱里面。
（4）样品测定：取3ml反应液加入50ul 山茶酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）。
（5）酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。
CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t）    (u/g min)
ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml， 1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml）。
    用紫外可见分光光度计，石英比色皿，测定的时候用缓冲液做空白调零。然后测的时候，先加反应液3ml，再加酶液0.1ml，摇匀。然后计时，测定吸光度的减小情况。本来测定的数据应该是减小的，0s时吸光度最大，40s时吸光度最小，呈下降趋势。但结果我测出来数据一直增大，这是为什么呢？是药品的问题，还是这个方法不适合测定山茶的过氧化氢酶的活性，还是其他的问题。
    请大侠赐教！！！非常非常感谢！！！

[ Last edited by senlinpeiyu on 2013-1-23 at 16:55 ]
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1楼2013-01-23 16:48:03
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
senlinpeiyu: 金币+1, ★有帮助, 我又磨了一批样，离心出来了，又测定了一次，还是不可以，步骤还是同样的步骤。 2013-01-23 19:08:58
xy656691: 金币+2, 感谢积极应助 2013-01-23 19:50:02
我以前也是用这种方法测CAT，该方法用于山茶应该也没有问题。你可以试试如下几条：
1 反应液检测前现用现配，加大H2O2用量试试（H2O2一般不会有什么问题，我以前都是放4度冰箱保存，但为了保险起见，重新买一瓶用吧）
2 加大样品用量，试试100 或200微升
3 你手头有没有商品过氧化氢酶，配一点过氧化氢酶溶液，用你的方法测一下，看吸光度如何变化。
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2楼2013-01-23 17:32:25
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普通回帖

xy656691

金虫 (正式写手)
楼主，往这看！

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3楼2013-01-24 20:56:54
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senlinpeiyu

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2013-01-23 17:32:25
我以前也是用这种方法测CAT，该方法用于山茶应该也没有问题。你可以试试如下几条：
1 反应液检测前现用现配，加大H2O2用量试试（H2O2一般不会有什么问题，我以前都是放4度冰箱保存，但为了保险起见，重新买一瓶用吧 ...

4楼2013-01-25 21:52:47
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senlinpeiyu

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xy656691 at 2013-01-24 20:56:54
楼主，往这看！

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谢谢了！！！
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5楼2013-01-25 21:53:17
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senlinpeiyu

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2013-01-23 17:32:25
我以前也是用这种方法测CAT，该方法用于山茶应该也没有问题。你可以试试如下几条：
1 反应液检测前现用现配，加大H2O2用量试试（H2O2一般不会有什么问题，我以前都是放4度冰箱保存，但为了保险起见，重新买一瓶用吧 ...

还是不可以，，我是SOD、POD、CAT一块测定的，在磨样的时间没有加入PVP，是不是和这个有关系啊？
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6楼2013-01-25 21:55:45
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by senlinpeiyu at 2013-01-25 21:55:45
还是不可以，，我是SOD、POD、CAT一块测定的，在磨样的时间没有加入PVP，是不是和这个有关系啊？...

PVP影响不大，以前我试过单纯在磷酸盐缓冲液里冰浴研磨，虽说效果不好，但酶活还是可以测出来的。我建议的方案3你有做么？检测结果如何？
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7楼2013-01-25 22:24:11
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senlinpeiyu

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by starseacow at 2013-01-25 22:24:11
PVP影响不大，以前我试过单纯在磷酸盐缓冲液里冰浴研磨，虽说效果不好，但酶活还是可以测出来的。我建议的方案3你有做么？检测结果如何？...

3方案就准备做呢，我以为是PVP的问题呢。
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8楼2013-01-26 11:20:29
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christine严

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也是同样的问题 请问一下楼主的问题解决了吗  用什么方法呢  我的过氧化氢都换了好几瓶了趋势都是下降的 也不知道怎么回事
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9楼2013-04-09 19:12:12
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senlinpeiyu

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by christine严 at 2013-04-09 19:12:12
我也是同样的问题 请问一下楼主的问题解决了吗  用什么方法呢  我的过氧化氢都换了好几瓶了趋势都是下降的 也不知道怎么回事

1.可以买过氧化氢酶，配一点过氧化氢酶溶液，用你的方法测一下，看吸光度如何变化。一直想这样做但没有时间。
2.比色是一定要用石英比色皿。
3.可以尝试把H2O2稀释，在测定。如果不行，可以用下面的方法。
4.过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法
    【原理】
过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。


R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH－)


R(Fe+3OH－)2+H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2
    据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2
5H2O2+2KMnO4+4H2SO4       5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4
    即可求出消耗的H2O2的量。
   【仪器和用具】
研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25ml×1。
    【试剂】
10% H2SO4；0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8；
0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；
0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；
0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4 •2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。
    【方法】
    1.酶液提取  取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
    2.取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。
3.用0.1mol/L KMnＯ4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。
    4.结果计算：
    酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：
          酶活(mgH2O2/gFW•min)=
式中  A—对照KMnO4滴定毫升数；
          B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；
          VT—酶液总量（ml）；
          V1—反应所用酶液量（ml）;
          W—样品鲜重（g）；
          1.7—1ml 0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2。
    【注意】
    所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定
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10楼2013-04-10 09:29:01
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