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senlinpeiyu

铜虫 (小有名气)

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[求助] 植物山茶过氧化氢酶（CAT）活性测定问题已有2人参与

1、过氧化氢酶（CAT）活性测定
（1）试剂配制：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4•12H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4•2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.15mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。
（2）反应液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）摇匀即可。
（3）酶液制备：取0.1g（因为叶片非常少，取了0.1g的样）叶片，洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。酶液提取出来后，当天没有测定，于是把酶液保存在4度冰箱里面。
（4）样品测定：取3ml反应液加入50ul 山茶酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）。
（5）酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。
CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t） (u/g min)
ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml， 1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml）。
用紫外可见分光光度计，石英比色皿，测定的时候用缓冲液做空白调零。然后测的时候，先加反应液3ml，再加酶液0.1ml，摇匀。然后计时，测定吸光度的减小情况。本来测定的数据应该是减小的，0s时吸光度最大，40s时吸光度最小，呈下降趋势。但结果我测出来数据一直增大，这是为什么呢？是药品的问题，还是这个方法不适合测定山茶的过氧化氢酶的活性，还是其他的问题。
请大侠赐教！！！非常非常感谢！！！

[ Last edited by senlinpeiyu on 2013-1-23 at 16:55 ]

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1楼2013-01-23 16:48:03

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senlinpeiyu

铜虫 (小有名气)

引用回帖:

2楼: Originally posted by starseacow at 2013-01-23 17:32:25
我以前也是用这种方法测CAT，该方法用于山茶应该也没有问题。你可以试试如下几条：
1 反应液检测前现用现配，加大H2O2用量试试（H2O2一般不会有什么问题，我以前都是放4度冰箱保存，但为了保险起见，重新买一瓶用吧 ...

4楼2013-01-25 21:52:47

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starseacow

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
senlinpeiyu: 金币+1, ★有帮助, 我又磨了一批样，离心出来了，又测定了一次，还是不可以，步骤还是同样的步骤。 2013-01-23 19:08:58
xy656691: 金币+2, 感谢积极应助 2013-01-23 19:50:02

我以前也是用这种方法测CAT，该方法用于山茶应该也没有问题。你可以试试如下几条：
1 反应液检测前现用现配，加大H2O2用量试试（H2O2一般不会有什么问题，我以前都是放4度冰箱保存，但为了保险起见，重新买一瓶用吧）
2 加大样品用量，试试100 或200微升
3 你手头有没有商品过氧化氢酶，配一点过氧化氢酶溶液，用你的方法测一下，看吸光度如何变化。