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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 综合其他 » 植物山茶过氧化氢酶（CAT）活性测定问题
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senlinpeiyu

铜虫 (小有名气)

[求助] 植物山茶过氧化氢酶（CAT）活性测定问题已有2人参与

1、过氧化氢酶（CAT）活性测定
（1）试剂配制：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4•12H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4•2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.15mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。
（2）反应液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）摇匀即可。
（3）酶液制备：取0.1g（因为叶片非常少，取了0.1g的样）叶片，洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。酶液提取出来后，当天没有测定，于是把酶液保存在4度冰箱里面。
（4）样品测定：取3ml反应液加入50ul 山茶酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）。
（5）酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。
CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t）    (u/g min)
ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml， 1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml）。
    用紫外可见分光光度计，石英比色皿，测定的时候用缓冲液做空白调零。然后测的时候，先加反应液3ml，再加酶液0.1ml，摇匀。然后计时，测定吸光度的减小情况。本来测定的数据应该是减小的，0s时吸光度最大，40s时吸光度最小，呈下降趋势。但结果我测出来数据一直增大，这是为什么呢？是药品的问题，还是这个方法不适合测定山茶的过氧化氢酶的活性，还是其他的问题。
    请大侠赐教！！！非常非常感谢！！！

[ Last edited by senlinpeiyu on 2013-1-23 at 16:55 ]
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1楼2013-01-23 16:48:03
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by senlinpeiyu at 2013-01-25 21:55:45
还是不可以，，我是SOD、POD、CAT一块测定的，在磨样的时间没有加入PVP，是不是和这个有关系啊？...

PVP影响不大，以前我试过单纯在磷酸盐缓冲液里冰浴研磨，虽说效果不好，但酶活还是可以测出来的。我建议的方案3你有做么？检测结果如何？
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
7楼2013-01-25 22:24:11
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
senlinpeiyu: 金币+1, ★有帮助, 我又磨了一批样，离心出来了，又测定了一次，还是不可以，步骤还是同样的步骤。 2013-01-23 19:08:58
xy656691: 金币+2, 感谢积极应助 2013-01-23 19:50:02
我以前也是用这种方法测CAT，该方法用于山茶应该也没有问题。你可以试试如下几条：
1 反应液检测前现用现配，加大H2O2用量试试（H2O2一般不会有什么问题，我以前都是放4度冰箱保存，但为了保险起见，重新买一瓶用吧）
2 加大样品用量，试试100 或200微升
3 你手头有没有商品过氧化氢酶，配一点过氧化氢酶溶液，用你的方法测一下，看吸光度如何变化。
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2013-01-23 17:32:25
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xy656691

金虫 (正式写手)
楼主，往这看！

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3楼2013-01-24 20:56:54
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senlinpeiyu

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2013-01-23 17:32:25
我以前也是用这种方法测CAT，该方法用于山茶应该也没有问题。你可以试试如下几条：
1 反应液检测前现用现配，加大H2O2用量试试（H2O2一般不会有什么问题，我以前都是放4度冰箱保存，但为了保险起见，重新买一瓶用吧 ...

4楼2013-01-25 21:52:47
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