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fanxiaojuan

金虫 (小有名气)

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[交流] 黄孢子原毛平革菌木素过氧化物酶，锰过氧化物酶，漆酶酶活测定

我用的方法如下：
木素过氧化物酶（LiP）测定：取 0.2mL 藜芦醇溶液（10mmol•L-1）、0.4mL 酒石酸缓冲液（250mmol•L-1，pH=3.0）与 0.4mL 粗酶液混匀，即得 1mL 反应液。在 30℃下，于反应液中加 20μLH2O2溶液（20mmol•L-1）启动酶促反应，以未加启动因子的反应液为参比，用紫外分光光度计（UV-2550）测定 310nm 处 2min 前后反应液吸光度的变化。一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化藜芦醇产生 1μmol藜芦醛所需的酶量。
锰过氧化物酶（MnP）测定：将 0.2113g MnSO4溶解于 1L 酒石酸缓冲液（50mmol•L-1，pH=4.5）中，取 0.8mL 该溶液同 0.2mL 粗酶液混匀，即得 1mL 反应液。在 30℃下，于反应液中加 20μLH2O2溶液（20mmol•L-1）启动酶促反应，以未加启动因子的反应液为参比，用紫外分光光度计（UV-2550）测定 290nm 处2min 前后反应液吸光度的变化。一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化 Mn2+产生 1μmol Mn3+所需的酶量。
漆酶采用ABTS法
但测出吸光度是负值，请大家帮忙分析一下并提出宝贵意见，还有不解的是怎么把吸光度的变化转化为酶活，还有就是测定2min钟前后的吸光度变化，这两分钟怎么选取，随便选取两分钟即可吗，或者大家有没有测这几种酶的具体方法，能否分享一下，拜托各位了！

[ Last edited by fanxiaojuan on 2012-5-17 at 17:05 ]

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1楼 2012-05-17 17:02:11

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xxnly

金虫 (小有名气)

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★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanxiaojuan: 金币+2, 谢谢你的热心帮助，很有帮助 2012-05-18 14:18:08

引用回帖:

26楼: Originally posted by fanxiaojuan at 2012-05-18 10:52:41:
我觉得也需要标准曲线呢，但不会做哦，又找不到具体的方法，请问你可有具体的方法吗？不胜感激

产物是藜芦醛，应该是配制藜芦醛溶液，按照你的反应体系，把底物和酶的部分换成一系列浓度的藜芦醛溶液，在要求的条件下测定应该就可以了。关于标准溶液的配制和梯度设计，很多书上都有。

反应的2min那里，因为做了没有启动反应的对照，用启动反应的实验组藜芦醛产量减去没有启动反应的藜芦醛量就可以了。反应时间就是2分钟，即在加入启动剂之后计时2min后可以测了吧。或者是在反应之前测定吸光度，反应2min后再测一次，但是这个不是很好控制。

有时候中文文献不是很可靠，可以综合几个文献看看相关实验方法，或者看看英文文献之类的。试验中如果发现文献中有错误你可以自己纠正自己一步步揣摩。酶的测定方法很多都是底物和产物反应，测定生成物的吸光度这样，多看看文献。你这个实验我也没做过，只是按照一般的思路分析而已，可能说的不对，还请你多包涵。