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fanxiaojuan

金虫 (小有名气)

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[交流] 黄孢子原毛平革菌木素过氧化物酶，锰过氧化物酶，漆酶酶活测定

我用的方法如下：
木素过氧化物酶（LiP）测定：取 0.2mL 藜芦醇溶液（10mmol•L-1）、0.4mL 酒石酸缓冲液（250mmol•L-1，pH=3.0）与 0.4mL 粗酶液混匀，即得 1mL 反应液。在 30℃下，于反应液中加 20μLH2O2溶液（20mmol•L-1）启动酶促反应，以未加启动因子的反应液为参比，用紫外分光光度计（UV-2550）测定 310nm 处 2min 前后反应液吸光度的变化。一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化藜芦醇产生 1μmol藜芦醛所需的酶量。
锰过氧化物酶（MnP）测定：将 0.2113g MnSO4溶解于 1L 酒石酸缓冲液（50mmol•L-1，pH=4.5）中，取 0.8mL 该溶液同 0.2mL 粗酶液混匀，即得 1mL 反应液。在 30℃下，于反应液中加 20μLH2O2溶液（20mmol•L-1）启动酶促反应，以未加启动因子的反应液为参比，用紫外分光光度计（UV-2550）测定 290nm 处2min 前后反应液吸光度的变化。一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化 Mn2+产生 1μmol Mn3+所需的酶量。
漆酶采用ABTS法
但测出吸光度是负值，请大家帮忙分析一下并提出宝贵意见，还有不解的是怎么把吸光度的变化转化为酶活，还有就是测定2min钟前后的吸光度变化，这两分钟怎么选取，随便选取两分钟即可吗，或者大家有没有测这几种酶的具体方法，能否分享一下，拜托各位了！

[ Last edited by fanxiaojuan on 2012-5-17 at 17:05 ]

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1楼 2012-05-17 17:02:11

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方林明

铁杆木虫 (正式写手)

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（最常用的）漆酶活力测定方法——愈创木酚法
50mmol/L琥珀酸钠为缓冲液（pH4.5），在10mL反应混合液中含0.04mmol愈创木酚和1mL粗酶液，30℃反应30min后，于465nm处测定吸光度。以灭活的酶液反应混合液为对照。
注意事项：
a 底物愈创木酚用95%乙醇溶解，使1mL乙醇中溶有0.04mmol愈创木酚，即4.5μL
b 50mmol/L琥珀酸钠缓冲液（pH4.5）的配制方法：称取NaOH1g，琥珀酸5.9g，溶于蒸馏水800mL，然后用1mmol/L的NaOH溶液调pH至4.5,定容至1000mL
c 反应体系：
1mL 95%乙醇（溶有0.04mmol愈创木酚）+1mL粗酶液+8mL琥珀酸钠缓冲液
d 酶液灭活方法：沸水浴中2——5分钟
粗酶液制备
发酵液经7200r/min离心，上清液即为粗酶液。酶活高时用琥珀酸钠缓冲溶液适当稀释。
酶活单位定义:
1min内催化氧化1nmol愈创木酚的酶量为1个酶活单位（U）。
酶活计算公式:
酶活（U/mL）=10的6次方* V总*ΔA/(V酶*ε*Δt) （式1）
其中V总、V酶分别代表反应体系的总体积及反应酶液的体积
ε为吸光系数，愈创木酚的ε465=1.21×104mol-1?L?cm-1)