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fanxiaojuan

金虫 (小有名气)

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[交流] 黄孢子原毛平革菌木素过氧化物酶，锰过氧化物酶，漆酶酶活测定

我用的方法如下：
木素过氧化物酶（LiP）测定：取 0.2mL 藜芦醇溶液（10mmol•L-1）、0.4mL 酒石酸缓冲液（250mmol•L-1，pH=3.0）与 0.4mL 粗酶液混匀，即得 1mL 反应液。在 30℃下，于反应液中加 20μLH2O2溶液（20mmol•L-1）启动酶促反应，以未加启动因子的反应液为参比，用紫外分光光度计（UV-2550）测定 310nm 处 2min 前后反应液吸光度的变化。一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化藜芦醇产生 1μmol藜芦醛所需的酶量。
锰过氧化物酶（MnP）测定：将 0.2113g MnSO4溶解于 1L 酒石酸缓冲液（50mmol•L-1，pH=4.5）中，取 0.8mL 该溶液同 0.2mL 粗酶液混匀，即得 1mL 反应液。在 30℃下，于反应液中加 20μLH2O2溶液（20mmol•L-1）启动酶促反应，以未加启动因子的反应液为参比，用紫外分光光度计（UV-2550）测定 290nm 处2min 前后反应液吸光度的变化。一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化 Mn2+产生 1μmol Mn3+所需的酶量。
漆酶采用ABTS法
但测出吸光度是负值，请大家帮忙分析一下并提出宝贵意见，还有不解的是怎么把吸光度的变化转化为酶活，还有就是测定2min钟前后的吸光度变化，这两分钟怎么选取，随便选取两分钟即可吗，或者大家有没有测这几种酶的具体方法，能否分享一下，拜托各位了！

[ Last edited by fanxiaojuan on 2012-5-17 at 17:05 ]

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1楼 2012-05-17 17:02:11

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dearestff

金虫 (小有名气)

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引用回帖:

20楼: Originally posted by 方林明 at 2012-05-17 19:33:14
（最常用的）漆酶活力测定方法——愈创木酚法
50mmol/L琥珀酸钠为缓冲液（pH4.5），在10mL反应混合液中含0.04mmol愈创木酚和1mL粗酶液，30℃反应30min后，于465nm处测定吸光度。以灭活的酶液反应混合液为对照。
注 ...

我在文献里看的方法和你的大致相同：10 mL反应体系中, 含 50 mmol L- 1琥珀酸钠缓冲溶液(pH 值4. 5) , 0. 4 mmol L- 1的愈创木酚和0. 5 mL的酶液, 30℃条件下反应30 min 后, 于465 nm 处测OD 值.酶活力定义为: 以灭活的酶液反应混合物做对照, 1 min 内催化氧化1 nmoL 愈创木酚的酶量为1 U。
文献里愈创木酚的浓度配比不一样，而且没有说各个溶液加入的体积是多少。还有就是反应时间到底按30min算还是1mi算。
酶活单位定义:1min内催化氧化1nmol愈创木酚的酶量为1个酶活单位（U）。1nmol的话是不是要乘以10的9次方，也是我在文献里看到的。《木质素降解相关酶类测定标准方法研究》
发现不同文献里测LiP、MnP、Lac的方法都略有不同，自己测的酶活也是乱七八糟，忽大忽小，十分郁闷……求大神解惑指导