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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 通过RT-PCR 获得了一段保守序列 接着如何设计RACE引物
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人生初见

木虫 (小有名气)

[求助] 通过RT-PCR 获得了一段保守序列 接着如何设计RACE引物

如题
我要做的是一个未知基因， 依据已知物种的 对比设计出了引物，做了RT-PCR获得了大约500bp的片段，现在要获得全长，做RACE。
kit 中说设计3‘和5’引物各为sense 和antisense 引物，我现在又个很纠结的问题，一般测序结果的序列是正链还是负链呢？ 怎么知道测序结果是从5‘到3’ 还是从3‘到5’呢？然后怎么设计引物？
P.S.
我的电脑装的是win7  32位的，可以装PP5吗？ 装了个PP6好像不好用

我是RACE新手   请教各位大虾！！！
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wangweida2

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1楼 2012-04-09 18:04:12
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孙妙妙

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 夏小狼xia123 at 2013-05-05 23:24:27
同问！...

我已经做完实验，分享下心得，其实RACE引物的设计不难，首先要搞清楚不论是5'还是3'，都是以正义链来看方向的，所以3'RACE的引物是以反义链为模板，朝正义链3'的方向走（其实也想当于我们平时设计的上游引物），只要把这个方向问题搞清除了，其他就是按照它的原则，比如GC含量50%-70%，Tm值高于65度等，试剂盒说明书上的要求来就可以了。5'同理。希望对你有帮助
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好好做实验！
16楼2013-05-08 19:33:48
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我最经也要做RACE，但也是新手呀，刚刚看了下3‘和5’RACE的原理和步骤，算是懂一点了，但不知道到时实验做起来会怎么样，祝我俩好运吧！
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2楼2012-04-09 19:32:34
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普通回帖

人生初见

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xuzhu598 at 2012-04-09 19:32:34:
我最经也要做RACE，但也是新手呀，刚刚看了下3‘和5’RACE的原理和步骤，算是懂一点了，但不知道到时实验做起来会怎么样，祝我俩好运吧！

那请问你的引物是如何设计的呢？一般测序结果的序列是正链还是负链呢？我很想知道这个问题的答案  谢谢
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3楼2012-04-09 20:27:35
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人生初见

木虫 (小有名气)
怎么没有人回复呢  是问题太低级吗
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4楼2012-04-09 20:42:21
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linyanfei

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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人生初见: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-06-07 22:39:38
公司测序回来的结果都是由5‘到3’端的，你在设计3‘端和5’端的时候需要设计两个特异引物，做巢式PCR。3’端正向，5‘端为反向互补，满足引物设计原则就可以了
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5楼2012-04-09 21:48:50
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chenxiang29

银虫 (正式写手)
我跟lz也要做相同的东西，纯新手，希望以后交流。。。
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smile to the world
6楼2012-04-09 21:51:57
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 人生初见 at 2012-04-09 20:27:35:
那请问你的引物是如何设计的呢？一般测序结果的序列是正链还是负链呢？我很想知道这个问题的答案  谢谢

就是根据模板链设计的啊，测序结果都是正链，5‘到3’的！
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7楼2012-04-10 13:55:36
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人生初见

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by linyanfei at 2012-04-09 21:48:50:
公司测序回来的结果都是由5‘到3’端的，你在设计3‘端和5’端的时候需要设计两个特异引物，做巢式PCR。3’端正向，5‘端为反向互补，满足引物设计原则就可以了

我用的是 PCR产物结果直接去测序的 也是5‘到3’吗？
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8楼2012-04-10 19:20:37
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梦之奋斗

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by linyanfei at 2012-04-09 21:48:50:
公司测序回来的结果都是由5‘到3’端的，你在设计3‘端和5’端的时候需要设计两个特异引物，做巢式PCR。3’端正向，5‘端为反向互补，满足引物设计原则就可以了

表示我也是要做RACE的新手，我连原理都木有看明白，5‘端的RACE和巢式PCR的关系是神马？引物设计还是和设普通引物一样么？
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9楼2012-04-10 20:34:25
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梦之奋斗

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xuzhu598 at 2012-04-09 19:32:34:
我最经也要做RACE，但也是新手呀，刚刚看了下3‘和5’RACE的原理和步骤，算是懂一点了，但不知道到时实验做起来会怎么样，祝我俩好运吧！

我也是新手，同道中人！多多交流哈！
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10楼2012-04-10 20:38:09
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