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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 通过RT-PCR 获得了一段保守序列 接着如何设计RACE引物
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wcwluwei

禁虫 (小有名气)
★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-07 13:36:24
本帖内容被屏蔽
11楼2012-05-06 21:28:55
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spritfood

新虫 (初入文坛)
同新手，但我觉得lz不用管测序结果是那条链，你按照你自己已有的保守序列做引物就是了，测序结果你拿来做比对嘛，比对不上就拿互补序列做比对嘛
我觉得是这样的，lz这个问题若解决了，可以说一下怎么解决的么，大家交流一下
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12楼2012-06-05 11:13:04
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lanjb1013

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

呵呵，很简单的一个问题，把目的基因放到ncbi上比对，和同源基因相比，看她和其他的同源基因的位置在哪里，第二，排序是不是也是从低到高。
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13楼2012-06-05 23:42:29
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孙妙妙

金虫 (小有名气)
我也是新手，请问特异引物到底要怎么设计啊？3’RACE的引物是上游还是下游引物啊？
我是通过几个物种比对后获得保守序列，设计特异引物获得了保守区，想用RACE来获得全长，但是怎么设计RACE引物，搞不清，到底怎么根据我测序获得的序列来设计RACE引物，忘各位大侠指教。
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好好做实验！
14楼2012-07-16 16:09:41
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夏小狼xia123

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 孙妙妙 at 2012-07-16 16:09:41
我也是新手，请问特异引物到底要怎么设计啊？3’RACE的引物是上游还是下游引物啊？
我是通过几个物种比对后获得保守序列，设计特异引物获得了保守区，想用RACE来获得全长，但是怎么设计RACE引物，搞不清，到底怎么 ...

同问！
回复此楼
恩
15楼2013-05-05 23:24:27
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孙妙妙

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 夏小狼xia123 at 2013-05-05 23:24:27
同问！...

我已经做完实验，分享下心得，其实RACE引物的设计不难，首先要搞清楚不论是5'还是3'，都是以正义链来看方向的，所以3'RACE的引物是以反义链为模板，朝正义链3'的方向走（其实也想当于我们平时设计的上游引物），只要把这个方向问题搞清除了，其他就是按照它的原则，比如GC含量50%-70%，Tm值高于65度等，试剂盒说明书上的要求来就可以了。5'同理。希望对你有帮助
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好好做实验！
16楼2013-05-08 19:33:48
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夏小狼xia123

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 孙妙妙 at 2013-05-08 19:33:48
我已经做完实验，分享下心得，其实RACE引物的设计不难，首先要搞清楚不论是5'还是3'，都是以正义链来看方向的，所以3'RACE的引物是以反义链为模板，朝正义链3'的方向走（其实也想当于我们平时设计的上游引物），只 ...

多谢！请问你3‘用试剂盒没？我想了解一下具体过程，包括各体系成分的浓度，用量等。
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恩
17楼2013-05-10 12:57:37
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z7531242

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
人生初见: 金币+1, ★有帮助 2013-07-10 05:42:15
現在大部分都是用SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit User Manual 這組方便又快速，方法步驟跟試劑protocal裡面都寫得很清楚。簡單的說...
5'RACE :primer設計在為Reverse
3'RACE: primer設計在為Forward
然後將5'跟3'回?淼男蛄袑Τ梢欢稳L的序列ATG...............TAA (CDS)    之後就看你要做甚麼瞜^^
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18楼2013-07-09 17:29:47
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wangweida2

新虫 (小有名气)
送红花一朵
测序结果的序列取决于你是用上游还是下游引物设计，上游引物作为测序引物结果就是正链，下游引物就是负链。但最终结果是一致的，反向互补一下就可以了。
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19楼2013-07-14 08:25:41
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suguolian

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 孙妙妙 at 2013-05-08 19:33:48
我已经做完实验，分享下心得，其实RACE引物的设计不难，首先要搞清楚不论是5'还是3'，都是以正义链来看方向的，所以3'RACE的引物是以反义链为模板，朝正义链3'的方向走（其实也想当于我们平时设计的上游引物），只 ...

我已得到了800bp作用的序列，现根据其设计了3‘RACE的引物，用的是宝生物的3’full RACe试剂盒，可以吗？之前做了两次没成功，也不知道是什么原因。做race的引物要很靠近末端吗？一般最大距离可到多少啊？我5‘end还有700多bp没测出，可做5’RACE吗？新手，请指导……
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20楼2013-09-28 21:50:15
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