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人生初见

木虫 (小有名气)

[求助] 通过RT-PCR 获得了一段保守序列 接着如何设计RACE引物

如题
我要做的是一个未知基因, 依据已知物种的 对比设计出了引物,做了RT-PCR获得了大约500bp的片段,现在要获得全长,做RACE。
kit 中说设计3‘和5’引物各为sense 和antisense 引物,我现在又个很纠结的问题,一般测序结果的序列是正链还是负链呢? 怎么知道测序结果是从5‘到3’ 还是从3‘到5’呢?然后怎么设计引物?
P.S.
我的电脑装的是win7  32位的,可以装PP5吗? 装了个PP6好像不好用

我是RACE新手   请教各位大虾!!!
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孙妙妙

金虫 (小有名气)

引用回帖:
15楼: Originally posted by 夏小狼xia123 at 2013-05-05 23:24:27
同问!...

我已经做完实验,分享下心得,其实RACE引物的设计不难,首先要搞清楚不论是5'还是3',都是以正义链来看方向的,所以3'RACE的引物是以反义链为模板,朝正义链3'的方向走(其实也想当于我们平时设计的上游引物),只要把这个方向问题搞清除了,其他就是按照它的原则,比如GC含量50%-70%,Tm值高于65度等,试剂盒说明书上的要求来就可以了。5'同理。希望对你有帮助
好好做实验!
16楼2013-05-08 19:33:48
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我最经也要做RACE,但也是新手呀,刚刚看了下3‘和5’RACE的原理和步骤,算是懂一点了,但不知道到时实验做起来会怎么样,祝我俩好运吧!
2楼2012-04-09 19:32:34
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普通回帖

人生初见

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by xuzhu598 at 2012-04-09 19:32:34:
我最经也要做RACE,但也是新手呀,刚刚看了下3‘和5’RACE的原理和步骤,算是懂一点了,但不知道到时实验做起来会怎么样,祝我俩好运吧!

那请问你的引物是如何设计的呢?一般测序结果的序列是正链还是负链呢?我很想知道这个问题的答案  谢谢
3楼2012-04-09 20:27:35
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人生初见

木虫 (小有名气)

怎么没有人回复呢  是问题太低级吗
4楼2012-04-09 20:42:21
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linyanfei

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
人生初见: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-06-07 22:39:38
公司测序回来的结果都是由5‘到3’端的,你在设计3‘端和5’端的时候需要设计两个特异引物,做巢式PCR。3’端正向,5‘端为反向互补,满足引物设计原则就可以了
5楼2012-04-09 21:48:50
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chenxiang29

银虫 (正式写手)

我跟lz也要做相同的东西,纯新手,希望以后交流。。。
smile to the world
6楼2012-04-09 21:51:57
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 人生初见 at 2012-04-09 20:27:35:
那请问你的引物是如何设计的呢?一般测序结果的序列是正链还是负链呢?我很想知道这个问题的答案  谢谢

就是根据模板链设计的啊,测序结果都是正链,5‘到3’的!
7楼2012-04-10 13:55:36
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人生初见

木虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by linyanfei at 2012-04-09 21:48:50:
公司测序回来的结果都是由5‘到3’端的,你在设计3‘端和5’端的时候需要设计两个特异引物,做巢式PCR。3’端正向,5‘端为反向互补,满足引物设计原则就可以了

我用的是 PCR产物结果直接去测序的 也是5‘到3’吗?
8楼2012-04-10 19:20:37
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梦之奋斗

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by linyanfei at 2012-04-09 21:48:50:
公司测序回来的结果都是由5‘到3’端的,你在设计3‘端和5’端的时候需要设计两个特异引物,做巢式PCR。3’端正向,5‘端为反向互补,满足引物设计原则就可以了

表示我也是要做RACE的新手,我连原理都木有看明白,5‘端的RACE和巢式PCR的关系是神马?引物设计还是和设普通引物一样么?
9楼2012-04-10 20:34:25
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梦之奋斗

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by xuzhu598 at 2012-04-09 19:32:34:
我最经也要做RACE,但也是新手呀,刚刚看了下3‘和5’RACE的原理和步骤,算是懂一点了,但不知道到时实验做起来会怎么样,祝我俩好运吧!

我也是新手,同道中人!多多交流哈!
10楼2012-04-10 20:38:09
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