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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 重叠延伸PCR引物合成求助
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小周

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 重叠延伸PCR引物合成求助

最近想把两个DNA片段连起来，想用SOE PCR的方法，看了半天引物设计时都没有搞明白。
假设我的片段A序列为：5’CGA GGATCCAG CATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG ........ ACT GGT GACCAT CAT CAC CAT CAC CAT3’

B片段的序列为：5’GACGATGACGACAAGccagtaccccc................agggctcttcggcaaatgtaaGTCGACCAGG3’

希望的结果为A在前B在后：
5’CGA GGATCCAG CATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG ........ ACT GGT GACCAT CAT CAC CAT CACCATGACGATGACGACAAGccagtaccccc................agggctcttcggcaaatgtaaGTCGACCAGG3’
中间两条引物该怎样设计呢？谢谢
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1楼 2012-03-24 12:26:05
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to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小周: 金币+5, ★有帮助 2012-03-26 17:08:32
1.设计2对引物，A5‘ &3’ ；B5‘&3’；A3‘和B5’ 引物有大于15bp的overlap。
2. 分别扩增A和B；
3.A和BPCR 产物等摩尔比混合，共同做模板，用A5‘和B3’扩增。
4.如果扩增效果不好，可以将A5‘和B3’ 向中间移动20左右bp重新设计引物扩增。

可以查看Overlap extension PCR
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生活是面镜子~
7楼2012-03-25 14:58:23
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查看全部 16 个回答

颜英

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小周: 金币+2, ★有帮助 2012-03-26 17:07:52
引物的设计不是有软件吗？我的实验也需要设计引物，师姐推荐我用primer premier5这个软件，因为我的目的基因还没确定，所以这个软件我还没用过，不知好不好用呵呵。。。
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2楼2012-03-24 13:17:14
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小周

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 颜英 at 2012-03-24 13:17:14:
引物的设计不是有软件吗？我的实验也需要设计引物，师姐推荐我用primer premier5这个软件，因为我的目的基因还没确定，所以这个软件我还没用过，不知好不好用呵呵。。。

这个我知道，呵呵。连接片段稍微麻烦点。
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3楼2012-03-24 14:57:01
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小周: 金币+3, ★有帮助, 网上的例子也看了，我大概也知道应该是样子，脑子有点笨，具体怎么设计想不明白。 2012-03-24 15:40:45
取A序列的末端20个和B序列的前端20个，分别与A和B进行PCR，再回收产物做模板进行第二次PCR。我只是举个例子，具体的引物你还得仔细分析一下。
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
4楼2012-03-24 15:14:51
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