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小周铁杆木虫 (著名写手)
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[求助]
重叠延伸PCR引物合成求助
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最近想把两个DNA片段连起来，想用SOE PCR的方法，看了半天引物设计时都没有搞明白。 假设我的片段A序列为：5’CGA GGATCCAG CATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG ........ ACT GGT GACCAT CAT CAC CAT CAC CAT3’ B片段的序列为：5’GACGATGACGACAAGccagtaccccc................agggctcttcggcaaatgtaaGTCGACCAGG3’ 希望的结果为A在前B在后： 5’CGA GGATCCAG CATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG ........ ACT GGT GACCAT CAT CAC CAT CACCATGACGATGACGACAAGccagtaccccc................agggctcttcggcaaatgtaaGTCGACCAGG3’ 中间两条引物该怎样设计呢？谢谢 |
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小周
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lvbobo823
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【答案】应助回帖
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小周: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-03-26 17:08:10
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就是搭桥PCR。设计引物时A片段3‘端取20bp左右的碱基，B片段5’端取20个碱基左右，总碱基不要超过50bp（大于50公司合成会比较贵），同时合成该引物反向互补片段。 用这条引物跟B片段的反向引物扩增B片段。再用这条引物反向互补序列为反向引物与A片段的正向引物扩增A片段。 把上一步扩增的A，B产物等摩尔混合再用A片段的正向引物与B片段的反向引物扩增，跑胶，回收你需要的大小的片段。 |
5楼2012-03-24 16:16:08
