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小周

铁杆木虫 (著名写手)

BioEPI: 2
应助: 42 (小学生)
金币: 11329.6
散金: 20
红花: 10
沙发: 1
帖子: 1324
在线: 560.7小时
虫号: 688224
注册: 2009-01-05
性别: MM
专业: 抗体工程学

[求助] 重叠延伸PCR引物合成求助

最近想把两个DNA片段连起来，想用SOE PCR的方法，看了半天引物设计时都没有搞明白。
假设我的片段A序列为：5’CGA GGATCCAG CATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG ........ ACT GGT GACCAT CAT CAC CAT CAC CAT3’

B片段的序列为：5’GACGATGACGACAAGccagtaccccc................agggctcttcggcaaatgtaaGTCGACCAGG3’

希望的结果为A在前B在后：
5’CGA GGATCCAG CATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG ........ ACT GGT GACCAT CAT CAC CAT CACCATGACGATGACGACAAGccagtaccccc................agggctcttcggcaaatgtaaGTCGACCAGG3’
中间两条引物该怎样设计呢？谢谢

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1楼2012-03-24 12:26:05

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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
telomerase: 金币+1, 谢谢你的热心应助 2012-03-24 20:36:38
小周: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-03-26 17:08:10

就是搭桥PCR。设计引物时A片段3‘端取20bp左右的碱基，B片段5’端取20个碱基左右，总碱基不要超过50bp（大于50公司合成会比较贵），同时合成该引物反向互补片段。
用这条引物跟B片段的反向引物扩增B片段。再用这条引物反向互补序列为反向引物与A片段的正向引物扩增A片段。
把上一步扩增的A，B产物等摩尔混合再用A片段的正向引物与B片段的反向引物扩增，跑胶，回收你需要的大小的片段。