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pfu扩增，菌液PCR问题
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各位虫友，我想咨询一下关于PFU扩增后连接T载体的问题，以及菌液PCR鉴定阳性菌问题，希望大家能给与帮助和支持！谢谢！ 1，PFU扩增后连接T载体问题。我经常用TAKARA的PYROBEST扩增后，跑胶，回收，用DATP加A，纯化，连接T载体。请问这样做如何？将扩增后的产物回收后，用T4 Polynucleotide Kinase将产物磷酸化处理，再和去磷酸化处理的T载体（如pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector）进行连接，转化，挑菌，菌液PCR鉴定阳性菌。请问这两种方法哪个效率较高？ 2，我经常遇到的问题是，加A 连接T载体后转化，能长很多菌斑，挑菌后做菌液PCR,阳性率很低很低，每次至少挑三四十管，甚至八九十管，运气好有2-3管阳性菌，运气差连一管阳性菌都没有！哎！很郁闷，我的片段有1900左右，用美莱博的PCR MIX。 请问我该怎么做才能使阳性率高？谢谢！ |
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