应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pfu扩增，菌液PCR问题
51/1返回列表
查看: 1590  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

billy8580

新虫 (初入文坛)

[求助] pfu扩增，菌液PCR问题

各位虫友，我想咨询一下关于PFU扩增后连接T载体的问题，以及菌液PCR鉴定阳性菌问题，希望大家能给与帮助和支持！谢谢！
1，PFU扩增后连接T载体问题。我经常用TAKARA的PYROBEST扩增后，跑胶，回收，用DATP加A，纯化，连接T载体。请问这样做如何？将扩增后的产物回收后，用T4 Polynucleotide Kinase将产物磷酸化处理，再和去磷酸化处理的T载体（如pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector）进行连接，转化，挑菌，菌液PCR鉴定阳性菌。请问这两种方法哪个效率较高？
2，我经常遇到的问题是，加A 连接T载体后转化，能长很多菌斑，挑菌后做菌液PCR,阳性率很低很低，每次至少挑三四十管，甚至八九十管，运气好有2-3管阳性菌，运气差连一管阳性菌都没有！哎！很郁闷，我的片段有1900左右，用美莱博的PCR MIX。
请问我该怎么做才能使阳性率高？谢谢！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-12-30 00:08:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hzlatqh

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励交流！GOOD! 2011-12-30 09:14:18
我也做过类似第一个方法的 但不像你说的阳性率这么低 。这样菌液pcr我觉得有个问题 。就是转化出来的菌落 其实即使是单菌落有时候也不是那么纯 特别是长出来一大版的情况  。你挑取菌落进行液体培养，如果混有空载质粒，肯定是空质粒的长的好，覆盖目的菌。这样菌落pcr就得不到阳性结果了。 当然 要是挑菌落的时候得到很纯的情况下 那就菌液pcr能得到阳性结果
赞一下(1人) 回复此楼
两个黄鹂鸣翠柳，一行白鹭上青天
2楼2011-12-30 00:22:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

caozi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+6): 鼓励新朋友回帖帮助他人！高额奖励，以资鼓励～ 2011-12-31 14:38:29
wanhscn(金币+6): 鼓励新朋友回帖帮助他人！高额奖励，以资鼓励～ 2011-12-31 14:38:35
一直都是pfu扩增后+A连T载体，上百基因没遇过这种情况，怀疑还是你操作哪里有问题
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2011-12-31 11:57:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1, 专家考核): 新年快乐！ 2012-01-01 10:18:15
加大抗性筛选力度
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2012-01-01 07:19:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

我也想知道啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊
赞一下 回复此楼
5楼2012-10-21 19:21:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 billy8580 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿北京化工大学 070300 学硕 336分 求调剂 +5 vv迷 2026-03-22 5/250 2026-03-23 07:36 by Iveryant
[考研] 323求调剂 +6 洼小桶 2026-03-18 6/300 2026-03-23 00:29 by king123！
[考研] 311求调剂 +6 冬十三 2026-03-18 6/300 2026-03-22 20:18 by edmund7
[考研] 318求调剂 +4 plum李子 2026-03-21 7/350 2026-03-22 14:17 by ColorlessPI
[考研] 285求调剂 +6 ytter 2026-03-22 6/300 2026-03-22 12:09 by 星空星月
[考研] 280求调剂 +11 咕噜晓晓 2026-03-18 12/600 2026-03-21 22:40 by ACS Nano——
[考研] 初试 317 +7 半拉月丙 2026-03-20 7/350 2026-03-21 22:26 by peike
[考研] 297求调剂 +11 戏精丹丹丹 2026-03-17 12/600 2026-03-21 17:47 by ColorlessPI
[考研] 材料 271求调剂 +5 展信悦_ 2026-03-21 5/250 2026-03-21 17:29 by 学员8dgXkO
[考研] 299求调剂 +4 某某某某位 2026-03-21 4/200 2026-03-21 16:30 by barlinike
[考研] 332求调剂 +3 凤凰院丁真 2026-03-20 3/150 2026-03-21 10:27 by luoyongfeng
[考研] 初始318分求调剂（有工作经验） +3 1911236844 2026-03-17 3/150 2026-03-21 02:33 by JourneyLucky
[考研] 材料 336 求调剂 +3 An@. 2026-03-18 4/200 2026-03-21 01:39 by JourneyLucky
[考研] 271材料工程求调剂 +8 .6lL 2026-03-18 8/400 2026-03-21 00:58 by JourneyLucky
[考研] 一志愿 西北大学 ，070300化学学硕，总分287，双非一本，求调剂。 +3 晨昏线与星海 2026-03-18 3/150 2026-03-21 00:46 by JourneyLucky
[考研] 296求调剂 +6 www_q 2026-03-18 10/500 2026-03-20 23:56 by JourneyLucky
[考研] 0856调剂，是学校就去 +8 sllhht 2026-03-19 9/450 2026-03-20 14:25 by 无懈可击111
[考研] 材料考研调剂 +3 xwt。 2026-03-19 3/150 2026-03-19 11:22 by w沐阳w
[硕博家园] 湖北工业大学 生命科学与健康学院-课题组招收2026级食品/生物方向硕士 +3 1喜春8 2026-03-17 5/250 2026-03-17 17:18 by ber川cool子
[考研] 考研调剂 +3 淇ya_~ 2026-03-17 5/250 2026-03-17 09:25 by Winj1e
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭