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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pfu扩增，菌液PCR问题
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billy8580

新虫 (初入文坛)

[求助] pfu扩增，菌液PCR问题

各位虫友，我想咨询一下关于PFU扩增后连接T载体的问题，以及菌液PCR鉴定阳性菌问题，希望大家能给与帮助和支持！谢谢！
1，PFU扩增后连接T载体问题。我经常用TAKARA的PYROBEST扩增后，跑胶，回收，用DATP加A，纯化，连接T载体。请问这样做如何？将扩增后的产物回收后，用T4 Polynucleotide Kinase将产物磷酸化处理，再和去磷酸化处理的T载体（如pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector）进行连接，转化，挑菌，菌液PCR鉴定阳性菌。请问这两种方法哪个效率较高？
2，我经常遇到的问题是，加A 连接T载体后转化，能长很多菌斑，挑菌后做菌液PCR,阳性率很低很低，每次至少挑三四十管，甚至八九十管，运气好有2-3管阳性菌，运气差连一管阳性菌都没有！哎！很郁闷，我的片段有1900左右，用美莱博的PCR MIX。
请问我该怎么做才能使阳性率高？谢谢！
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1楼 2011-12-30 00:08:29
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caozi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+6): 鼓励新朋友回帖帮助他人！高额奖励，以资鼓励～ 2011-12-31 14:38:29
wanhscn(金币+6): 鼓励新朋友回帖帮助他人！高额奖励，以资鼓励～ 2011-12-31 14:38:35
一直都是pfu扩增后+A连T载体，上百基因没遇过这种情况，怀疑还是你操作哪里有问题
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3楼2011-12-31 11:57:14
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hzlatqh

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励交流！GOOD! 2011-12-30 09:14:18
我也做过类似第一个方法的 但不像你说的阳性率这么低 。这样菌液pcr我觉得有个问题 。就是转化出来的菌落 其实即使是单菌落有时候也不是那么纯 特别是长出来一大版的情况  。你挑取菌落进行液体培养，如果混有空载质粒，肯定是空质粒的长的好，覆盖目的菌。这样菌落pcr就得不到阳性结果了。 当然 要是挑菌落的时候得到很纯的情况下 那就菌液pcr能得到阳性结果
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两个黄鹂鸣翠柳，一行白鹭上青天
2楼2011-12-30 00:22:42
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1, 专家考核): 新年快乐！ 2012-01-01 10:18:15
加大抗性筛选力度
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4楼2012-01-01 07:19:43
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

我也想知道啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊
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5楼2012-10-21 19:21:34
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