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billy8580

新虫 (初入文坛)

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[求助] pfu扩增，菌液PCR问题

各位虫友，我想咨询一下关于PFU扩增后连接T载体的问题，以及菌液PCR鉴定阳性菌问题，希望大家能给与帮助和支持！谢谢！
1，PFU扩增后连接T载体问题。我经常用TAKARA的PYROBEST扩增后，跑胶，回收，用DATP加A，纯化，连接T载体。请问这样做如何？将扩增后的产物回收后，用T4 Polynucleotide Kinase将产物磷酸化处理，再和去磷酸化处理的T载体（如pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector）进行连接，转化，挑菌，菌液PCR鉴定阳性菌。请问这两种方法哪个效率较高？
2，我经常遇到的问题是，加A 连接T载体后转化，能长很多菌斑，挑菌后做菌液PCR,阳性率很低很低，每次至少挑三四十管，甚至八九十管，运气好有2-3管阳性菌，运气差连一管阳性菌都没有！哎！很郁闷，我的片段有1900左右，用美莱博的PCR MIX。
请问我该怎么做才能使阳性率高？谢谢！

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1楼 2011-12-30 00:08:29

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caozi

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+6): 鼓励新朋友回帖帮助他人！高额奖励，以资鼓励～ 2011-12-31 14:38:29
wanhscn(金币+6): 鼓励新朋友回帖帮助他人！高额奖励，以资鼓励～ 2011-12-31 14:38:35

一直都是pfu扩增后+A连T载体，上百基因没遇过这种情况，怀疑还是你操作哪里有问题

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3楼2011-12-31 11:57:14

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hzlatqh

银虫 (小有名气)

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★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励交流！GOOD! 2011-12-30 09:14:18

我也做过类似第一个方法的但不像你说的阳性率这么低。这样菌液pcr我觉得有个问题。就是转化出来的菌落其实即使是单菌落有时候也不是那么纯特别是长出来一大版的情况。你挑取菌落进行液体培养，如果混有空载质粒，肯定是空质粒的长的好，覆盖目的菌。这样菌落pcr就得不到阳性结果了。当然要是挑菌落的时候得到很纯的情况下那就菌液pcr能得到阳性结果

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两个黄鹂鸣翠柳，一行白鹭上青天