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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 很奇怪的连接产物
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ycttfeng

木虫 (小有名气)

[求助] 很奇怪的连接产物

最近准备表达蛋白，首先扩增了目的片段，连到Blunt载体（3900多bp）上，测序正确。将目的片段（2200多bp）从Blunt上双酶切后回收，与pET16b（5700多bp）相连，挑了四个单克隆，提质粒双酶切后，总是出现这样的结果：目的片段大小是对的，但载体的大小不对。这到底是为什么为什么呢？已经出现了很多次这样的情况了，一直找不到原因。请各位高手指点

电泳图传不上来  郁闷啊。。。。。
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努力～
1楼 2011-12-21 10:12:25
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rintor

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
ycttfeng(金币+1): 2011-12-24 09:17:47
酶切多长时间？ 你确定载体上没有双酶切位点？
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不要轻易言败
2楼2011-12-21 11:48:35
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ycttfeng

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by rintor at 2011-12-21 11:48:35:
酶切多长时间？ 你确定载体上没有双酶切位点？

当初回收的时候是切过夜的 现在双酶切鉴定切了四个半小时 载体上有双酶切位点的啊
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努力～
3楼2011-12-21 12:26:30
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
ycttfeng(金币+1): 谢谢！确定切开了，我加了没有经过酶切的做了对照 2011-12-21 20:26:48
你确定你是切开了？会不会是根本没切开，电泳出来的是线性质粒和超螺旋的，大的片段亮度要比小片段亮很多，仔细看看
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在等待中涅槃重生
4楼2011-12-21 15:22:03
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ycttfeng(金币+2): ★★★很有帮助 高人啊！切完后，载体的大小差不多就是3900这样子，接近4000，所以我严重怀疑是Blunt载体，但是想想，我切完Blunt-目的片段后，回收了目的片段那部分啊，所以怎么可能呢。。。。。。百思不得其解。。。。。 2011-12-21 20:25:01
西瓜(金币+3): Good！ 2011-12-21 21:59:23
1、建议：单酶切和双酶切同时进行，切1-2h就足够了，不需要切4.5h，看看单酶切的时候总的大小是不是对的？
2、仔细检查pET16b载体上你选的那两个酶切位点是单一的
3、目前实验你发现酶切后载体变小了，那它现在是多少大小，和5700bp相差多少，和3900bp相差多少呢？？这个仔细看一下
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5楼2011-12-21 19:01:22
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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西瓜(金币+1): good 2011-12-22 18:33:18
ycttfeng(金币+1): 2011-12-22 22:13:41
做个空载体的双酶切对照看看
对你发现问题肯定有帮助
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6楼2011-12-21 21:04:18
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