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ycttfeng木虫 (小有名气)
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很奇怪的连接产物
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最近准备表达蛋白，首先扩增了目的片段，连到Blunt载体（3900多bp）上，测序正确。将目的片段（2200多bp）从Blunt上双酶切后回收，与pET16b（5700多bp）相连，挑了四个单克隆，提质粒双酶切后，总是出现这样的结果：目的片段大小是对的，但载体的大小不对。这到底是为什么为什么呢？已经出现了很多次这样的情况了，一直找不到原因。请各位高手指点 电泳图传不上来 郁闷啊。。。。。 |
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2楼2011-12-21 11:48:35
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4楼2011-12-21 15:22:03
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
ycttfeng(金币+2): ★★★很有帮助 高人啊！切完后，载体的大小差不多就是3900这样子，接近4000，所以我严重怀疑是Blunt载体，但是想想，我切完Blunt-目的片段后，回收了目的片段那部分啊，所以怎么可能呢。。。。。。百思不得其解。。。。。 2011-12-21 20:25:01
西瓜(金币+3): Good！ 2011-12-21 21:59:23
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ycttfeng(金币+2): ★★★很有帮助 高人啊！切完后，载体的大小差不多就是3900这样子，接近4000，所以我严重怀疑是Blunt载体，但是想想，我切完Blunt-目的片段后，回收了目的片段那部分啊，所以怎么可能呢。。。。。。百思不得其解。。。。。 2011-12-21 20:25:01
西瓜(金币+3): Good！ 2011-12-21 21:59:23
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1、建议：单酶切和双酶切同时进行，切1-2h就足够了，不需要切4.5h，看看单酶切的时候总的大小是不是对的？ 2、仔细检查pET16b载体上你选的那两个酶切位点是单一的 3、目前实验你发现酶切后载体变小了，那它现在是多少大小，和5700bp相差多少，和3900bp相差多少呢？？这个仔细看一下 |
5楼2011-12-21 19:01:22
panda73
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